اكثر سرطان¬ها و بيماري¬هايي كه هم اكنون گريبان¬گير انسان است، يك ريشه¬ي ژني دارد كه با اصلاح ژن¬ آسيب¬‌ديده مي¬توان انتظار داشت كه از بروز و پيشرفت بيماري جلوگيري شود. ژن¬درماني اميد¬ها را براي درمان گستره زيادي از بيماري¬ها مانند سرطان زنده نگه مي¬دارد. در واقع در ژن‌درماني پلاسميد براي بيان پروتئين درماني خاص و يا اليگونوكلئوتيدهايي براي خاموش كردن ژن ايجاد كننده بيماري بكار مي¬روند. تزريق مستقيم DNA خالص امكان‌پذير است ولي سلول¬هاي كمي DNA را برداشت كرده و احتمال كمي وجود دارد كه منجر به توليد پروتئين شود. اهميت اصلي پلاسميد خالص براي توسعه و توليد واكسن است كه مقدار كمي از پروتئين مي¬تواند منجر به ايجاد پاسخ ايمني دلخواه شود. در اغلب موارد استفاده از DNA خالص براي انتقال مواد ژنتيكي در شرايط درون‌تن مناسب نيست و اين امر به علت تخريب DNA به¬وسيله¬ي نوكلئازهاي سرم است. بنابراين معمولاً يك سيستم حامل توصيه مي¬شود كه بايستي زيست سازگار و غير ايمني¬زا باشد، از DNA در مقابل عوامل سيستم رتيكولواندوتليال محافظت كند و براي سلول يا بافت هدف ويژه باشد. انتظار مي¬رود كه فرايند ورود حامل نانويي به سلول آندوسيتوز باشد، بنابراين سيستم حامل بايستي توانايي فرار آندوزمي و رسانش DNA به هسته را داشته باشد. يك سيستم خوب بايستي حاوي انواع اجزا ساختماني براي رفتارهاي ويژه باشد. بنابراين با توجه به اهميت سيستم¬هاي تحويل ژن، مايع يوني بر پايه¬ي ايميدازول با خاصيت فلوئورساني بالا سنتز شد. نتايج مربوط به ژل الكتروفورز بارگيري، رهايش و محافظت بسيار خوب اين حامل از پلاسميد را نشان داد. تصوير ثبت شده با ميكروسكوپ فلوئورسنت نشان داد كه اين مايع يوني در مقايسه با ايميدازول تجاري داراي خاصيت فلوئورساني بيشتري است. با استفاده از تست MTT عدم سميت تركيب سنتز شده تاييد شد. امروزه در اكثر آزمايشات مربوط به ترانسفكشن از ليپوفكتامين استفاده مي¬شود اين ماده علي¬رغم مزيت¬هايي كه دارد در نسبت-هاي مشخصي اثر سمي بر سلول دارد. بنابراين حامل سنتز شده در مقايسه با نمونه تجاري موجود در بازار هيچ گونه سميتي نداشته و با هزينه بسيار كمتري توليد گرديد.

ژن‌درماني راهكاري نويدبخش براي درمان طيف گسترده‏اي از بيماري‏ها غير از اختلالات نادر وراثتي و تك ژني توجه بسياري را به خود جلب كرده است. دندريمرهاي پلي آميدوآمين داراي ساختارهاي دقيق، نسبت بالايي از سطح¬هاي چند ظرفيتي به حجم، ظرفيت بافري بالا، سطوح پلي كاتيوني، حلاليت در آب، ظرفيت حمل بالا، اصلاح سطح آسان و زيست سازگاري به‌عنوان وكتور تحويل ژن مورد توجه هستند. در اختراع حاضر براي اولين بار دندريمرهاي پلي آميدوآمين با استفاده از مولكول هيدرازين به‌عنوان هسته¬ي آغازگر سنتز شدند. G3PAMAM با هسته¬ي جديد با روش واگرا و استفاده از روش واكنشگرهاي اضافي سنتز شد. G3PAMAM داراي 16 گروه آمين اوليه سطحي و 14 آمين نوع سوم دروني است كه توانايي برهمكنش مؤثر با پلاسميد، ظرفيت حمل مقادير بالاي پلاسميد، توانايي اتصال و ورود به سلول، رهاسازي و فرار آندوزومي و عبور پلاسميد از غشاي هسته و بيان پروتئين موردنظر را دارد. تركيب حتي بدون اصلاح سطح به‌عنوان نانو حامل ژن رسان زيست سازگار عمل مي¬كند. اين تركيب مي¬تواند به‌عنوان حامل مؤثر و قدرتمند در انتقال ژن، جايگزين مناسب و قوي عوامل انتقال ژن موجود در بازار و مورد استفاده در تحقيقات باشد و به‌طور بالقوه در درمان بيماري¬هاي ژنتيكي و سرطان مورداستفاده قرار گيرد.

اينوزيتول تري فسفات (IP3) يك پيامبر ثانويه درون سلولي است كه باعث آزاد شدن كلسيم از ذخاير سلول شده و تنظيم كننده بسياري از واكنش هاي داخل سلولي است اختلال در اين مسير منجر به اختلالات متابوليسمي و بدنبال آن بسياري از بيماري ها و ناهنجاري هاي متابوليكي مي شود. اهميت متابوليكي بالاي اين مولكول آن را براي ساخت يك بيوسنسور مناسب مورد توجه قرار مي دهد. يكي از روش هاي بررسي نقش پروتئين ها و تركيبات موجود در سلول استراتژي قطعه قطعه كردن پروتئين هاي گزارشگر Split Reporter Protein Strategy است. براي سنجش مولكول هاي زيستي كوچك با تعبيه كردن دمين هاي حامل جايگاه اتصال مولكول مورد نظر درون ساختار پروتئين هاي گزارشگر مانند لوسيفراز سنسورهاي زيستي ايجاد مي شود بصورتي كه با اتصال مولكول به جايگاه خود پروتئين تغيير ساختار داده و متعاقب آن قطعات جدا شده پروتئين گزارشگر نيز به هم نزديك شده و با كامل شدن ساختار آن پروتئين گزارشگر مجددا فعال مي شود. در روش ارائه شده آنزيم گزارشگر لوسيفر از يك ناحيه خاص بريده شده بطوريكه هر كدام از قطعات ايجاد شده فاقد فعاليت آنزيمي باشند. سپس دو قطعه جدا شده لوسيفراز به دو طرف دمين اتصال يافنده به مولكول IP3 متصل شد. پلاسميد حامل قطعات اتصال يافته به سلول هاي HEK293T منتقل شده و فعاليت سنسور ساخته شده در حضور IP3 و همچنين تركيبات آزاد كننده IP3 مورد بررسي قرار گرفت. نتايج حاصل قابليت بالاي سنسور جهت سنجش ميزان IP3 را تاييد مي كند.

عنوان: توليد آنزيم فعال پراكسيداز گياهي در باكتري خلاصه اختراع: آنزيم¬هاي پراكسيداز گياهي يكي از پركاربردترين آنزيم¬ها بوده و در ساختارشان پيوند دي¬سولفيد داشته و براي فولد صحيح و فعاليت به كلسيم و هم (Heme) نياز دارند. تا كنون توليد نوتركيب اين آنزيم¬ها در سيستم پروكاريوتي به صورت اجسام غير¬فعال و نامحلول (اينكلوژن بادي) بوده كه بازيابي پروتئين به فرم محلول و فعال نياز به مراحل ريفولدنگ داشته است. ريفولدينگ علاوه بر هزينه بر بودن، زمانبر مي¬باشد و بخشي از پروتئين نيز طي فرايند از دست مي¬رود. در روش جديد، براي توليد ارزان و سريع پراكسيداز گياهي، از باكتري¬هاي مهندسي شده (مثل Escherichia coli T7 SHuffle) به عنوان ميزبان استفاده شد كه توانايي تشكيل پيوند دي سولفيدي را در سيتوپلاسم خود دارا مي-باشند. با تشكيل پيوندهاي دي¬سولفيدي، ساختار آنزيم به نحوي شكل مي¬گيرد كه با بهينه¬سازي اضافه نمودن كوفاكتورهاي آنزيم از قبيل كلسيم و هم به صورت مستقيم به محيط كشت، اين مواد در داخل باكتري در ساختار پروتئين قرار مي¬گيرند و پروتئين در حال توليد به سمت فرم محلول و فعال هدايت مي¬شود بطوريكه پس از تخليص قابل استفاده مي¬باشد. در اين روش ضمن توليد ارزانتر و سريعتر آنزيم، بازده توليد هم تقريبا دو برابر مي¬شود.

هدف در اينجا ساخت نيوزوم ارگوسترولي همراه با نانوذرات آهن براي تحويل هدفمند مواد فعال مي باشد. فناوري نانو موج چهارم انقلاب صنعتي، پديده‌اي عظيم است كه در تمامي گرايش‌هاي علمي راه يافته است.سرطان يكي از كشنده ترين بيماري هاي قرن حاضر مي باشد. روشهاي رايج براي درمان سرطان داراي معايبي از قبيل هزينه بالا، آسيب به سلولهاي سالم بدن، عدم انتخاب پذيري، دروه درمان بالا و ... مي باشند . نانوفناوري اميدها را براي درمان گستره زيادي از بيماري‌ها مانند سرطان زنده نگه مي‌دارد. نانونيوزوم ها كه وزيكول‌هايي دوگانه هستند به دليل ساختار منحصربه‌فردشان مي‌توانند براي تحويل داروي مورد نظر به سلول آسيب ديده استفاده شوند. با اين حال، نيوزوم هايي كه هم اكنون براي تحويل مواد فعال استفاده مي شوند داراي معايبي از قبيل اندازه بزرگ، توزيع اندازه غيرهمگن و زيست سازگاري كم مي باشند. براي رفع اين مشكل ما از ارگوسترول در ساختار نيوزوم استفاده كرديم كه ماده اي در دسترس و زيست سازگار است. در اختراع حاضر، سيستم تحويل دارو با استفاده از قرارگيري نانوذرات مغناطيسي آهن و داروي ضد سرطاني دوكسوروبيسين درون نيوزوم اصلاح شده با ارگوسترول تهيه شد و از اين سيستم براي تحويل دارو به تومور يا بافت مورد نظر براي اولين بار، استفاده شد. در ابتدا، نانوذارت آهن با استفاده از آناليزهاي FTIR, XRD, SEM و VSM مورد بررسي قرار گرفت. در ادامه، فرمولاسيون‌هاي نيوزومي با استفاده از روش هيدراتاسيون لايه نازك تهيه شد . نتايج DLS نشان داد كه فرمولاسيون ارگوسترولي داراي اندازه كوچك‌تر، پتانسيل زتاي منفي تر و توزيع اندازه بهتري است. سرعت آزادسازي فرمولاسيون ارگوسترولي آهسته تر از فرمولاسيون كلسترولي بود. سميت فرمولاسيون ارگوسترولي كمتر از فرمولاسيون كلسترولي بود و وجود نانوذره آهن درون فرمولاسيون باعث افزايش چشمگير خاصيت ضدسرطاني نانوحامل شد.

موفقيت سيستم هاي انتقالي به توانايي آن ها در تحويل ژن به سلول هاي هدف دارد و انتقال ماده ژنتيكي يك مانع بزرگ در تكامل سيستم هاي انتقال ژن مي باشد. با توجه به معايب سيستم هاي انتقال ژن ويروسي، بيشتر پژوهش ها بر روي طراحي ناقل هاي غير ويروسي با كارايي بالا متمركز مي باشد. يكي از كاراترين اين روش ها استفاده از ناقل هاي پپتيدي يا پروتئيني مي باشد. با اين حال همه پپتيدها كارايي لازم براي انتقال ژن را ندارند. طراحي پپتيدها يا پروتئين هاي كايمريك مي تواند كارايي اين ناقل ها را افزايش دهد. در اين اختراع سعي شد با طراحي و بيان پروتئين كايرمريك شامل دو تكرار پپتيد هسته اي آدنو ويروسي (Mu) با سيگنال انتقال به هسته اي NLS ناقلي با كارايي بالا براي انتقال ژن طراحي كردد. پپتيد μ از كمپلكس هسته آدنوويروسها جداسازي شده است.

وزيكل¬هاي تك لايه غول پيكر (GUV) مدل¬هاي غشايي هستند كه مي¬توان با استفاده از ميكروسكوپ ساختار و تغييرات آنها را به راحتي مشاهده كرد. اين وزيكل¬ها مدل¬هاي بسيار پر طرفداري براي مطالعه وقايع مرتبط با غشاء مي¬باشند. امروزه از اين وزيكل¬ها براي بررسي ويژگي¬هاي غشاء دولايه نيوزومي مثل انحناي غشاء، موفولوژي و بررسي دومين¬هاي غشايي استفاده مي¬گردد. تكنيك¬هاي زيادي براي آماده سازي GUVها وجود دارد كه شامل هيدراتاسيون آرام، تبخير حلال و استفاده از روش الكتروفورميشن مي¬باشد و الكتروفورميشن كاراترين و راحت¬ترين روش مي¬باشد. در تمامي تحقيقات پيشين از فسفوليپيدها براي تشكيل ليپوزوم¬هاي غول پيكر استفاده شده بود. هدف اين اختراع ساخت نيوزوم¬هاي غول پيكر براي نشان دادن مشابهت¬هاي بيشتر سورفاكتانت¬هاي غير يوني تشكيل دهنده نيوزومي با فسفوليپيدهاي تشكيل دهنده ليپوزومي و معرفي نيوزوم¬ها به عنوان جايگزيني مناسب براي كاربردهاي دارورساني و بررسي خصوصيات غشاء نيوزومي مي¬باشد.

ويروزوم ها وزيكول هاي فسفوليپيدي تك لايه كروي با ميانگين قطر حدود 150 نانومتر هستند كه لايه ليپيدي آن ها با پروتئين هاي ويروسي تركيب شده است. بر خلاف ليپوزوم ها، ويروزوم ها داراي گليكوپروتئين هاي پوشش(envelope) ويروسي مثل هماگلوتينين (HA) و نورآمينيداز (NA) در غشاي خود هستند كه آن ها را قادر مي سازد به راحتي با غشاء دو لايه اي فسفوليپيدي سلول هدف برهمكنش كنند و بتوانند به سلول وارد شوند. اين اختراع به تشكيل ويروزوم ها به وسيله نيوزوم ها براي اولين بار پرداخته است. نيوزوم ها ساختاري دولايه دارند كه از تركيب سورفكتانت هاي غيريوني با كلسترول و سپس هيدريشن در محيط آبي شكل گرفته و براي انتقال داروهاي هيدروفيل و ليپوفيل مورد استفاده قرار مي گيرند. نيوزوم ها مي توانند به صورت سيستميك و موضعي كاربرد داشته باشند. با توجه به اينكه نيوزوم ها تعدادي از مضرات ليپوزوم ها از جمله: قيمت بالا، متغير بودن خلوص فسفوليپيدها، و شرايط خاص نگهداري را برطرف كرده اند امروزه مطالعات زيادي براي جايگزين كردن نيوزوم ها به جاي ليپوزوم ها صورت مي گيرد. در اين اختراع با ساخت و فرمولاسيون نيوزومي و قرار دادن پروتئين سطحي ويروس VSV در غشاء نيوزوم، ناقل جديدي براي اولين بار در ايران و جهان كه توانايي انتقال ماده محبوس شده را دارد، طراحي گرديد.

در اين مطالعه، آنزيم D-لاكتات دهيدروژناز به صورت تك مرحله اي به صورت فعال و محلول توليد شد. براي توليد اين آنزيم ابتدا توالي ژن كد كننده ي آنزيمD –لاكتات دهيدروژناز در بانك ژن پايگاه NCBI با عدد دسترسي(EC 1.1.1.28) يافت شد. سپس بر اساس ترجيح كدوني ميزبان باكتريايي Ecoli سويه ي BL21 با استفاده از نرم افزار Geneious و نيز وب سايت هاي Jcat و IDT تغييرات لازم انجام شد. سپس توالي مورد نظر بعد از طراحي به شركت Biobasic سفارش داده شد. بعد از تحويل گرفتن توالي سنتز شده در داخل وكتورPUC ، مراحل كلونينگ براي انتقال ژن به داخل وكتور بياني pET28a انجام شد. به منظور توليد پروتئين نوتركيب ، باكتري هاي حامل وكتور نوتركيب در محيط كشت TB به مدت 10 ساعت در دماي 18 درجه سانتي گراد با غلظت 1 ميلي مولار IPTG القا شدند. پس از توليد پروتئين و خالص سازي آن با استفاده از ستون كروماتوگرافي ميل تركيبي نيكل-سفارز، به منظور اطمينان از تاخوردگي صحيح و تعيين فعاليت آنزيم نوتركيب توليد شده ، از كاهش جذب NADH در حضور پيروات و آنزيم مذكور در طول موج 340 نانومتر استفاده شد. . نتايج حاصل از فولد صحيح و عملكردي بودن پروتئين نشان مي دهد كه اين پروتئين براي كاربردهاي پزشكي و ساخت بيوسنسورهاي تشخيصي و همچنين استفاده در صنايع گوناگون وابسطه به D-LDH مناسب است. در ضمن در اين مطالعه با استفاده از استراتژي هاي مختلف، موفق به كاهش هزينه تمام شده توليد نوتركيب اين پروتئين شديم كه از نظر اقتصادي بسيار با اهميت است. از جمله استراتژي ها مي توان به مهندسي سويه جهت توليد حداكثري پروتئين و نيز استفاده از ميزبان باكتريايي كه داراي رشد و تكثير سريع و نيز پايين بودن قيمت محيط كشت جهت رشد باكتري اشاره كرد. آنزيم D-LDH نو تركيب توليد شده در اين مطالعه داراي غلظت متوسط 205 ميلي گرم بر ليتر پروتيئن خالص سازي شده مي باشد كه از بالاترين غلظت هايي است كه تاكنون گزارش شده است.

1-با توجه به افزايش روز افزون تحقيقات در زمينه سرطان و ساخت تركيبات شيمي درماني جديد ، توانايي اين داروها در القاي مرگ سلولي يك اصل اوليه و بسيار مهم در بررسي كيفيت و تاثيرگذاري آن ها مي باشد. 2-بررسي ميزان القاي مرگ سلولي در مراحل اوليه اولويت دارد زيرا زماني كه سلول وارد فاز آپوپتوز(مرگ سلولي) مي شود، اولين اتفاق درمراحل اوليه ي مرگ سلولي ، جابجا شدن و انتقال فسفاتيديل سرين از سمت داخلي غشاي پلاسمايي به سمت بيروني غشا است كه دراين صورت اين تركيب در معرض قرار مي گيرد و هنوز يكپارچگي غشاي سلول حفظ شده و غشا همچنان يكپارچه و پايدار است. 3-تشخيص افتراقي آپوپتوز از نكروز، اصلي مهم است و سنجش فسفاتيديل سرين ها در آپوپتوز اختصاصيت دارد. براي بررسي آپاپتوز در سلولها چند روش بكار ميرود كه عبارتند از : 1- ژل الكتروفورز 2- ميكروسكوپ الكتروني 3- ميكروسكوپ نوري 4- نشاندار كردن قطعه انتهايي 5- تكنيك هاي فلوئورسنس 6- نشان دار كردن با فسفاتيديل سرين از آنجايي كه در مراحل اوليه آپاپتوز، فسفاتيديل سرين از سطح داخلي غشاء پلاسمايي به سطح خارجي آن منتقل مي شود و در آنجا براي رساندن پيام مرگ به سلولهاي مجاور فاگوسيتهاي عملكردي جهت بلعيدن سلول عمل مي نمايند، در روشي جديد براي نشان دادن سلول هاي آپاپتوزي ، Annexin V كه عضوي از خانواده انكسين ها است را بكار مي برند. Annexin با واسطه ++ ca مي تواند به فسفو ليپيد متصل شود و براي نشان دادن سلولهاي آپاپتوزي در محيط هاي كشت و يا مقاطع بافتي كه توسط FITC- AnnexinVفيكس شده اند، بكار برود. سنجش مرگ برنامه ريزي شده ي سلول از طريق پروب Annexin V-FITC بر اين اساس استوار است كه در مراحل اوليه ي مرگ برنامه ريزي شده ي سلول ، تغييراتي در سطح سلولي اتفاق مي افتد. يكي از اين تغييرات، جابجا شدن و انتقال فسفاتيديل سرين از سمت داخلي غشاي پلاسمايي به سمت بيروني غشا است كه دراين صورت اين تركيب در معرض قرار مي گيرد و از آنجايي كه انكسينv پروتئيني وابسته به كلسيم با تمايل بسيار بالا براي اتصال به فسفاتيديل سرين مي باشد، با انتقال فسفاتيديل سرين بر روي سطح غشا ، اتصال بين اين فسفوليپيد و انكسينV اتفاق مي افتد. درنتيجه اگر پروتئين انكسينV به يك تركيب فلوئورسنت متصل باشد ميتوان اتصال آن به فسفاتيديل سرين را تشخيص داد. در طراحي اين پروب، از تكنولوژي كانژوگه كردن تركيب فلوئورسنتFITC به پروتئين انكسينV استفاده شد. از آنجايي كه بهم خوردن تقارن غشا و انتقال فسفاتيديل سرين از سمت داخلي غشا به سمت بيرون در مراحل اوليه مرگ سلولي اتفاق مي افتد ، تشخيص به موقع و زود هنگام مرگ سلولي توسط اين پروب براي بررسي تركيبات و داروهاي شيمي درماني امري اجتناب ناپذير و مهم مي باشد. بعد از تيمار سلول ها با استفاده از داروهاي شيمي درماني همانند دوكسوروبيسين و شروع فرآيند القاي مرگ سلولي ، براي بررسي درصد مرگ سلولي از پروب انكسين FITC- استفاده شد. نتايج به دست آمده نشان دهنده ي كارايي بالاي اين پروب در تشخيص سلول هاي آپوپتوي وافتراق آن ها از سلول هاي نكروزي مي باشد.