اختراع آنتي بادي نوتركيب تك زنجيره عليه گيرنده سلولهاي بنيادي سرطاني LGR5 در زمينه بيوتكنولوژي پزشكي مي باشد. در حال حاضر درمانهاي هدفمند براي برخي از ماركرهاي سرطان وجود دارد ولي ماركر سلول هاي بنيادي سرطاني (Cancer stem cell) كه بنظر مي رسد نقش اصلي در عدم پاسخ به درمانهايي مانند شيمي درماني و متاستاز دارند تحت درمان هدفمند قرار نگرفته اند. توليد آنتي بادي نوتركيب تك زنجيره شاخة بسيار مهمي از علومي مانند ايمونولوژي و بيوتكنولوژي را تشكيل مي دهند. هدف از توليد آنتي بادي نوتركيب تك زنجيره براي LGR5، بدست آوردن محصولي جهت استفاده در درمان سرطان و نيز در تست هاي تشخيصي ماركر فوق است. از جمله موارد استفاده مي توان به استفاده از آن در درمان سرطان هاي گوارشي از جمله معده و كولون كه اين ماركر در آنها بيان بالايي دارد اشاره كرد. براي توليدآنتي بادي از تكنيك فاژ ديسپلي و كتابخانه Tomlinson استفاده شد. ارزيابي ويژگي كلون هاي جدا شده برضد LGR5 با استفاده از تست هاي فاژ الايزا و وسترن بلات انجام گرفت. براي بررسي اثر از تست MTT و براي بررسي قدرت تشخيصي تست ايمونوفلورسانس گذاشته شد.

اين اختراع در زمينه زيست فن آوري پزشكي و توليد آنتي بادي نوتركيب عليه گيرنده ErbB3 است. گيرنده هاي خانواده ErbB نقش مهمي در رشد و پيشرفت انواع مختلفي از سرطان‌ها دارند. توسعه روش‌هاي درماني سرطان پستان بر پايه شناسايي مكانيسم‌هاي بيان و تنظيم ژن‌ها و عملكرد مسيرهاي سيگنالينگ دخيل در سرطان، استوار بوده كه منجر به توليد داروهايي نظير آنتي‌بادي نوتركيب ( Trastuzumab (Herceptin عليه گيرنده ErbB2 گرديد. با اين وجود، سلولهاي توموري با روشهايي مختلف از جمله: انتقال پيام از طريق ساير اجزاي اين گيرنده ها، مانع كار آرايي و ايجاد مقاومت نسبت به اين داروها مي شوند. در اين راستا اختراع حاضر با هدف غلبه بر مقاومت دارويي در سلولهاي توموري سرطان پستان، آنتي بادي نوتركيب، با قابليت بلوك همزمان انتقال پيام از طريق گيرنده‌هاي ErbB2 و ErbB3 ساخته شد. در اين اختراع، پس از توليد سلولهاي پايدار ErbB3 و ارزيابي بيان اين گيرنده در سطح رده سلولي VERO، توليد آنتي بادي نوتركيب ضد گيرنده ErbB3 صورت گرفت. آنتي بادي توليد شده در اين اختراع قادر به مهار رشد سلول هاي سرطان پستان در محيط آزمايشگاه بود. هم افزايي تاثير مهار توام انتقال پيام گيرنده هاي ErbB2 و ErbB3 توسط آنتي بادي توليد شده در اين اختراع نشان دهنده قابليت آن در درمان بيماران مبتلا به سرطان پستان و جلوگيري از پيدايش مقاومت دارويي در اين بيماران است.

سودوموناس آئروژينوزا يكي از شايع ترين ميكروارگانيسم هاي بيماري زا در عفونت هاي چشمي به ويژه در قرنيه و ملتحمه مي باشد. كراتوكونژكتيويت سودومونائي ناشي از تروما، خراشيدگي ،لنزهاي درماني ، لنزهاي زيبايي، تماس با آب آلوده، از عفونت هاي چشـمي خطرنـاك مي باشد كه اگر فورأ درمان مناسب براي آن انجام نشود، مي توانند منجر به ناتواني شديد در ديد و زخم قرنيـه و ملتحمه شوند. سودوموناس آئروژينوزا يك پاتوژن فرصت طلب بوده كه مقاومت فراواني نسبت به آنتي بيوتيكها كسب كرده است كه همين امر باعث مشاركت فراوان آن در عفونتهاي بيمارستاني مي شود. اصلي تـرين مكانيسم هاي مقـاومت آنتي بيوتيكي سودوموناس آئروژينوزا : نفوذپذيري پايين سل وال (مقاومت ذاتي) ، توليد بتالاكتامازها، آمينوگليكوزيدازها و سفالوسپورينازهاي خارج سلولي با منشا كروموزومي يا پلاسميدي ، تغيير در جايگاههاي پروتئيني اتصال به آنتي بيوتيك ها ، مكانيسم افلاكس فعال كه آنتي بيوتيك را به خارج پمپ ميكند، مي باشند. در كنار ظهور و گسترش مقاومت آنتي بيوتيكي در اين باكتري ، حضور فاكتورهاي بيماري زايي در اين باكتري در عفونت هاي چشمي از جمله حضور اگزوتوكسين S ،اگزوتوكسين U ،الاستاز، آلكـالين پروتئـاز استراتژي درماني را مورد تهديد قرار داده است . در سال هاي اخير باتوجه به افزايش سوش هاي MDR( multidrug resistance) و بازگشت عفونت ها نياز به جستجوي يك گزينه درماني جديد مي باشد. فاژها بعنوان گزينه درماني جديد پيشنهاد مي شوند. فاژها بعنوان يك بيو پارتيكل كاملا هوشمند هستند كه مي¬توانند باكتري هاي MDR (multidrug resistance) را از بين ببرند، كاملا اختصاصي عمل مي كنند و باعث از بين بردن فلور طبيعي بدن نمي شوند، سلول هاي يوكاريوتيك را تحت تاثير قرار نمي دهند، برخلاف آنتي بيوتيك ها نياز به تنظيم دوز ندارند و مقاومت به آنها گزارش نشده است. شكست در درمان عفونت هاي چشمي ناشي از تروما، خراشيدگي ،لنزهاي تماسي، تماس با آب آلوده نه تنها بعلت ظهور گونه هاي باكتريايي مقاوم به آنتي بيوتيك ها مي باشد بلكه چشم نيز ساختار پيچيده ايي داشته كه خود مانع اصلي در جذب داروهاي چشمي عمل مي نمايد . در حال حاضر داروهاي تجاري براي درمان عفونت هاي چشمي به اشكال قطره ، پماد و سوسپانسيون استفاده مي شوند.در استفاده از قطره به دليل اين كه دارو سريع از چشم خارج شده و ماده موثره حذف مي گردد و از طرفي براي رفع اين مشكل چنانچه از دوزهاي بالاي ماده موثره استفاده گردد همراه با عوارض جانبي متعدد و آسيب به بافت چشم خواهد بود. لذا در عفونت هاي چشمي جهت موفقيت در درمان به افزايش ماندگاري فرآورده در چشم، كاهش غلظت موثره دارو، جذب و نفوذ آن در قسمت هاي پشتي چشم نياز به فرمولاسيون جديد دارويي نيز مي باشد. سيستم دارو رساني بر مبناي انتقال از حالت محلول (سل ،Sol) به حالت ژل (In situ gelling eye drop)بعنوان سيستم دارويي پايدار پيشنهاد مي گردد. اين تغيير حالت فراورده چشمي محلول (سل ،Sol) به ژل بر اساس چندين پارامتر مانند: pH، دما، تغيير حلال و يون ها مي باشد. در اين مطالعه تغيير حالت فراورده چشمي محلول (سل ، Sol) به ژل بر اساس تغييرات pH مي باشد. (In situ gelling eye drop) سيستم دارو رساني جديد سبب رها سازي طولاني مدت دارو ، كاهش دوز موثره دارو، كاهش عوارض جانبي و آسيب هاي بافتي چشمي، و بهبودي فراهمي زيستي قطره چشمي مي شود. 1- مقصود اختراع (OBJECT OF THE INVENTION) 1-\tاستفاده از حضور باكتريوفاژها در زمينه دارويي و پزشكي جهت درمان و حذف عفونت هاي چشمي ناشي از باكتري سودوموناس آئروژينوزا كه بطور همزمان مقاوم به چندين آنتي بيوتيك مي باشد. 2-\tاستفاده از باكتريوفاژهادر فرمولاسيون قطره چشمي ژل شونده جهت توليد محصولات دارويي كاملا هوشمند كه بطور اختصاصي عمل كرده و تنها به ميزبانش باكتري سودوموناس آئروژينوزا متصل مي شود. 3-\t استفاده از باكتريوفاژها در فرمولاسيون قطره چشمي ژل شونده جهت توليد محصولات دارويي كاملا اختصاصي كه بر خلاف آنتي بيوتيك ها بر فلور نرمال انساني و سلول هاي يوكاريوتيك تاثير ندارند. 4-\tاز آنجايي كه باكتريوفاژها در محل عفونت خود تكثير شونده هستند استفاده از آنها در فرمولاسيون قطره چشمي ژل شونده جهت توليد محصولات دارويي در مقياس بسيار زياد كه از نظر اقتصادي مقرن به صرفه مي باشند وبر خلاف آنتي بيوتيك ها نياز به تنظيم دوز ندارند. 5-\tاستفاده از باكتريوفاژها در فرمولاسيون قطره چشمي ژل شونده جهت توليد محصولات دارويي همراه با كاهش دوز موثره دارو . 6-\tاستفاده از باكتريوفاژها در فرمولاسيون قطره چشمي ژل شونده جهت توليد محصولات دارويي براي عفونت هاي ناشي از باكتري هاي (MDR). 7-\tاستفاده از تكنولوژي ساخت فرآورده هاي چشمي In situ gelling eye drop بعنوان سيستم دارويي پايدار. 8-\tاستفاده از تكنولوژي جديد In situ gelling eye drop جهت رها سازي طولاني مدت دارو، افزايش ماندگاري فرآورده در چشم و در نتيجه كاهش غلظت ماده موثره. 9-\tاستفاده از تكنولوژي جديد In situ gelling eye drop جهت كاهش عوارض جانبي و آسيب هاي بافتي چشمي و بهبودي فراهمي زيستي قطره چشمي مي شود. 2- برجستگيهاي تكنيكي اختراع (FEATURES OF THE INVENTION) 1-\tباكتريوفاژها قادر هستند عفونت هاي چشمي ناشي از باكتري سودوموناس آئروژينوزا كه بطور همزمان مقاوم به چندين آنتي بيوتيك مي باشند را حذف و از بين ببرند. 2-\tباكتريوفاژها بعنوان ماده موثره در قطره چشمي ژل شونده قادر هستند در شرايط In vivo بعنوان محصولات دارويي كاملا هوشمند كه بطور اختصاصي عمل كرده و تنها به ميزبانشان باكتري سودوموناس آئروژينوزا متصل بشوند. 3-\tباكتريوفاژها بعنوان ماده موثره در قطره چشمي ژل شونده كاملا اختصاصي عمل مي كنند و بر خلاف آنتي بيوتيك ها بر فلور نرمال انساني و سلول هاي يوكاريوتيك تاثير ندارند. 4-\tاز آنجايي كه باكتريوفاژها در محل عفونت خود تكثير شونده هستند استفاده از آنها در فرمولاسيون قطره چشمي ژل شونده سبب توليد خودشان در مقياس بسيار زياد شده كه از نظر اقتصادي مقرن به صرفه مي باشند وبر خلاف آنتي بيوتيك ها نياز به تنظيم دوز ندارند. 5-\tباكتريوفاژها در فرمولاسيون قطره چشمي ژل شونده سبب حذف عفونت هاي ناشي از باكتري هاي (MDR) در شرايط In vivo مي شوند. 6-\tداروهاي تجاري حاضر جهت درمان عفونت هاي چشمي بصورت قطره يا سوسپانسيون مي باشند كه بهمراه عوارض جانبي كه بر بافت چشم دارند بعلت حذف سريع از چشم كارايي مناسب جهت درمان را نخواهند داشت. در اين روش از جديدترين تكنولوژي ساخت فرآورده هاي چشمي In situ gelling eye drop بعنوان سيستم دارويي پايدار استفاده گرديده است. 7-\tتكنولوژي جديد In situ gelling eye drop بر خلاف قطره هاي موجود رها سازي طولاني مدت دارو، افزايش ماندگاري فرآورده در چشم و كاهش دوز موثره دارو مي گردد. 8-\tتكنولوژي جديد In situ gelling eye drop بر خلاف گزينه اي درماني موجود براي عفونت هاي چشمي سبب كاهش عوارض جانبي و آسيب هاي بافتي چشمي، و بهبودي فراهمي زيستي قطره چشمي مي گردد. 9-\tاستفاده از قطره ژل شونده حاوي باكتريوفاژ جهت حذف عفونت و التهاب در كراتوكونژكتيويت سودومونائي استفاده مي شود. 10-\tاستفاده از قطره ژل شونده حاوي باكتريوفاژ جهت انجام فرآيند ترميم در بيماران مبتلا به كراتوكونژكتيويت سودومونائي استفاده مي شود. 3- زمينه فني اظهارنامه اختراع (FIELD OF APPLICATION) دارويي – پزشكي

در اين پروژه ابتدا طراحي پرايمرقطعه مورد نظر انجام شد و سپس تكثير توالي مورد نظر به روش PCR انجام شد. سپس كلونينگ و تكثير قطعات ژني مورد نظر در TA وكتور انجام شد. تاييد كلونينگ انجام شده به روش PCR تاييد گرديد. سپس استخراج پلازميد از باكتري انجام شد. پس از آن TA وكتور و هم چنين وكتور بياني PGEX توسط آنزيم هاي اختصاصي برش خورد و قطعه مورد نظر جداسازي گرديد. طي عمل لايگيشن قطعه استخراج شده وارد وكتور بياني وارد و كلونينگ انجام شد. پس از تاييد به روش PCR بيان صورت گرفت و سپس تاييد بيان به روش SDS و وسترن انجام شد. در نهايت تخليص پروتئين با استفاده از كروماتوگرافي انجام شد.

اپي توپ هاي ايمونوژنيك B-cell و T-cell از آنتي ژن هاي SAG1، MIC4 وROP18 مربوط به انگل توكسوپلاسما را با استفاده از روش بيوانفورماتيك و نرم افزارهاي آنلاين مختلف پيش بيني كرديم. سازه پروتئيني RMS حاوي سه اپي توپ مشترك سلول B و T از ژن هاي SAG1، MIC4 وROP18 توسط لينكر rigid با بهترين چينش به هم متصل و بعنوان كانديد مناسب واكسن ارائه شد. ساختار دوم و سوم پروتئين پيش بيني شد. بهينه سازي كدون ها بر اساس E. coli k12 انجام گرفت. همچنين ساختار دوم mRNA مربوط به سازه پيش بيني و سازگاري كدون بررسي شد. اين سازه پروتئيني به پلاسميد pET28a+ منتقل گرديد. پلاسميد به باكتري Escherichia coli(E.coli) سويه (BL21) ترانسفورم و باكتري مستعد شد. در نهايت، اين آنتي ژن پروتئيني توليد و پس از تأييد بيان پروتئين به روش SDS PAGE و وسترن بلات با استفاده از كروماتوگرافي ميل تركيبي تخليص گرديد و در ادامه كار جهت ارزيابي ايمني سلولي و خوني در موش هاي BALB/c ايمن شده با اين آنتي ژن، مورد استفاده قرار خواهد گرفت. اين واكسن برخلاف واكسن هاي تهيه شده از انگل هاي زنده يا ضعيف شده، خطر فعال شدن انگل را ندارد و با هزينه كمتر و زمان كوتاه تر به مقادير مختلف قابل توليد است.

در اين اختراع وكتور ويروسي نوتركيب ،جهت مهندسي ژنتيك سلول هاي يوكاريوتي توليد گرديد اين وكتور قادر است فاكتور رشد مشتق از مغز "BDNF" را در سطح اگزوزوم هاي ازاد شده ازسلول هاي مهندسي شده بيان كند . بيان BDNF باعث هدفمند سازي اگزوزوم عليه گيرنده مغزي TRAKb مي شود كه درسلول هاي هيپوكمپ بيان مي گرديد از اين طريق مي توان از اگزوزوم هاي تغيير يافته جهت انتقال مواد دارويي و ژنتيكي به سلول هاي مغزي استفاده كرد. در وكتور حاضربخش اتصالي ژن BDNF به گيرنده TRKb توسط يك لينگر به ژن LAMP2 متصل مي گردد. وجود پروتئين LAMP2 در كنار پروتئين BDNF باعث بيان و ظهور اين پروتئين در سطح اگزوزوم هاي مشتق شده از سلول هاي هدف مي شود. وكتور طراحي شده باعث ادغام ژن نوتركيب LAMP-BDNF در ژنوم سلول هاي هدف و بيان دائمي آن مي شود.در واقع منجر به ايجاد سل لايني با بيان پايدار پروتئين BDNF در سطح اگزوزوم مي شود.

اختراع حاضر در زمينه پزشكي و زيست فناوري و در مورد ابداع يك سيستم جهت توليد و ارزيابي آنتي‌بادي‌هاي نوتركيب عليه دامين دايمريزاسيون گيرنده HER2 مي‌باشد. سرطان پستان شايع‌ترين سرطان در بين زنان در كشورهاي توسعه‌يافته و درحال‌توسعه است. در دهه‌هاي گذشته توسعه روش‌هاي درمان سرطان پستان بر فهم مكانيسم‌هاي بيان و تنظيم ژن‌ها و عملكرد مسيرهاي سيگنالينگ دخيل در شروع و توسعه سرطان استوار بوده است. از مشخص‌ترين مثال‌هاي اين نوع درمان، توليد آنتي‌بادي نوتركيب Trastuzumab (Herceptin) عليه گيرنده HER2 جهت درمان بيماران مبتلابه سرطان پستان است. بااين‌حال فاز تقريباً تمامي افرادي كه پاسخ اوليه را به اين دارو نشان مي‌دهند طي كمتر از يك سال به آن مقاوم مي‌شوند. با توجه به عدم كارآمدي آنتي‌بادي Herceptin نسل جديدي از آنتي‌بادي‌هاي نوتركيب به نام Pertuzumab معرفي شدند. ويژگي اصلي اين آنتي‌بادي مهار رشد سلول‌هاي سرطاني از طريق اتصال به دامين دايمريزاسيون گيرنده HER2 مي‌باشد. با اين وجود به علت ساختار ويژه گيرنده HER2 طراحي و توليد آنتي‌بادي عليه دامين دايمريزاسيون آن به‌عنوان يكي از مشكلات بزرگ مطرح است. در اينجا روشي ابداع شده است كه از طريق آن مي‌توان به‌راحتي به آنتي‌بادي‌هاي ضد دامين دايمريزاسيون دست يافت. در اين روش دامين دايمريزاسيون گيرنده HER2 از نظر خصوصيات فيزيكي و ايمونولوژيك مورد بررسي قرار گرفت. سپس با استفاده از اطلاعات به دست آمده يك گيرنده HER2 جديد ابداع و ساخته شد و كه از نظر ساختار و نحوه قرارگيري دامين دايمريزاسيون با گيرنده HER2 طبيعي متفاوت است. گيرنده HER2 جديد به نحوي طراحي شده است كه فاقد چندين اسيدآمينه دخيل در تشكيل دهنده دامين دايمريزاسيون مي‌باشد به صورتي كه پس از توليد در سلول، اين گيرنده فاقد دامين دايمريزاسيون مي‌باشد. با در دست داشتن اين گيرنده جديد از طريق تكنيك subtractive phage display به‌راحتي مي‌توان آنتي‌بادي‌هاي ضد دامين دايمريزاسيون گيرنده HER2 را توليد كرد بعلاوه از اين سيستم در ارزيابي آنتي‌بادي‌هاي موجود نيز مي‌توان بهره گرفت.

سلول هاي بنيادي سرطاني (CSC) عامل متاستاز، عود، هتروژنيتي، مقاومت در برابر عوامل شيمي درماني، راديوتراپي و در نتيجه عدم موفقيت در درمان سرطان مي باشند. فعاليت نا به جاي مسير Wnt نقش مهمي در تشكيل و حفظ انواعي از CSC ها از جمله سرطان پستان، سرطان هاي دستگاه گوارش، سرطان ريه و سرطان پوست دارد. از آنجاييكه سيگنالينگ Wnt در خودبازسازي، تومورزايي و تمايز سلول هاي سرطاني به CSC ها نقش دارد، هدف قرار دادن CSC ها با مهار سيگنالينگ Wnt مي تواند رويكرد درماني اميدوار كننده در درمان سرطان باشد. مسير Wnt از ده گيرنده FZD و نوزده ليگاند Wnt تشكيل شده است. از بين اعضاي خانوادهFZD ، FZD7 در انواع مختلف سرطان ها افزايش بيان دارد. افزايش بيان گيرنده FZD7 با متاستاز، عود و مقاومت دارويي سلول هاي سرطاني ارتباط مستقيم دارد. در اختراع حاضر كه براي اولين بار در كشور انجام شد، دمين خارج سلولي گيرنده FZD7 (FZD7 CRD) به روش نوتركيب توليد شد. به علاوه، FZD7 CRD در مهار تكثير و القا آپوپتوز سلول هاي سرطان معده AGS و سرطان كولون SW480 مورد بررسي قرار گرفت. FZD7 CRD محلول مي تواند مسير سيگنالينگ Wnt / β-catenin را توسط اتصال رقابتي با ليگاند هاي Wnt مهار نمايد كه در نتيجه از اتصال ليگاند هاي Wnt با گيرنده هاي FZD7 سطح سلولي ممانعت مي شود. بنابراين پروتئين نوتركيب FZD7 CRD با مهار مسير Wnt مي تواند در ممانعت از تشكيل و حفظ سلول هاي بنيادي سرطاني اثرگذار باشد.