اختراع حاضر مربوط به توليد كيت الايزا تشخيص سرولوژي بيماران مبتلا به بروسلوز (تب مالت) مي باشد. در اين كيت براي اولين بار يك تركيب آنتي ژني حاوي whole cell Brucella abortus S99 lysates به عنوان ماده ليز شده كل پيكره باكتري بروسلا و به منظور تشخيص آنتي بادي كلاس IgM ضد باكتري بروسلا در سرم انسان استفاده گرديده است. تشخيص سريع و دقيق بيماري بروسلوز در فاز هاي اوليه توسط اختراع فوق سبب كاهش زمان و هزينه هاي درماني مي شود. معرف هاي كيت شامل آنتي ژن whole cell Brucella abortus S99 lysates كوت شده در پليت 96 خانه اي الايزا، محلول كونژوگه (آنتي بادي بزي ثانويه كونژوگه با HRP بر عليه IgM انسان)، محلول رقيق كننده و شوينده، محلول سوبسترا و محلول نگه دارنده واكنش مي باشد. غلظت مطلوب شده آنتي ژن براي كوت كردن در پليت معادل 7 ug/mLمحاسبه گرديده است. آنتي ژن به كار گرفته شده به واسطه واكنش متقاطع بين سويه ها قابليت تشخيص تمام سويه هاي صاف بروسلا را دارد. همچنين به واسطه استاندارد سازي هاي صورت پذيرفته در مواد و محلول هاي كيت فوق، اختراع حاضر ميزان حساسيت و اختصاصيت نتايج را نسبت به ساير كيت هاي مشابه افزايش داده است.

پلاسميد pMB-IRES جهت انتخاب سريعتر و دقيق تر كلونهاي سلولي مداوم توليد كننده پروتئين نو تركيب در سيستم بياني سلولهاي حشره

در اين بررسي ما براي اولين مرتبه با استفاده از تكنولوژي فيوژن پروتيين، فيوژن FimH.FliC را از سويه هاي بومي كشورمان به عنوان كانديد واكسن جديد عليه عفونت ادراري ايجاد شده توسط سويه هاي اشريشياكلي يوروپاتوژنيك ساخته و پس از بيان آن، بررسي خصوصيات پروتيين حاصله و مطالعات مختلف حيواني را انجام داده و احتمال استفاده از اين فيوژن پروتيين را به عنوان كانديد واكسن جديد مورد بررسي قرار داديم. به طور خلاصه مي توان گفت كه در مجموع اين مطالعه پروتيين فيوژن FimH.FliC را به عنوان كانديد واكسن جديد عليه عفونت ادراري ايجاد شونده توسط سويه هاي اشريشياكلي يوروپاتوژنيك معرفي كرد كه به خوبي توانست در اولين مرحله از مطالعه حيواني نتايج اميدواركننده اي از خود نشان دهد. البته براي معرفي اين كانديد واكسن مطالعات بيشتر حيواني در فازهاي ديگر بايستي انجام شود كه در صورت موفقيت آميز بودن اين نتايج مي توان اين كانديد واكسن را براي فازهاي انساني آماده كرد.

عفونت دستگاه ادراري جزو شايعترين عفونتهاي اكتسابي از جامعه و بيمارستان بوده بطوريكه آنرا در رديف دومين بيماري عفوني و نيز سومين عفونت معمول در بين عفونت هاي باكتريايي قرار مي دهند. اشريشياكلي يوروپاتوژنيك (UPEC) شايعترين و مهمترين عامل ايجاد اين نوع عفونت است. درمان روتين عفونت هاي ادراري علامت دار بر پايه استفاده از آنتي بيوتيك هاي مختلف است. مطالعات انجام گرفته در مناطق مختلف، مقاومت بالاي عوامل ايجاد كننده عفونت ادراري از جمله اشريشياكلي يوروپاتوژنيك را به بسياري از آنتي بيوتيك ها نشان داده كه اين مقاومت در حال افزايش نيز مي باشد. مطالعات انجام گرفته در ايران نيز مقاومت بالايي به آنتي بيوتيك هاي معمول در درمان عفونت ادراري را ذكر كرده اند و بسياري از سويه هاي UPEC عامل اين عفونت ها مقاومت چند دارويي داشته اند. بنابراين افزايش مقاومت به آنتي بيوتيك هاي درماني عفونت ادراري مي تواند آينده اين بيماري را با معضلات عظيمي مواجه كند. از طرف ديگر استفاده از آنتي بيوتيك ها به عنوان تركيبات شيميايي احتمال آسيب به بدن بيمار را نيز بالا مي برد. همچنين سويه هاي UPEC قادر به نفوذ به داخل سلول هاي مخاط ادراري و تشكيل منابع داخل سلولي بوده كه اين منابع داخل سلولي و اشكال شبه بيوفيلم آنها نيز سبب بي اثر شدن بسياري از آنتي بيوتيك هاي روتين در درمان عفونت ادراري مي شوند. از طرف ديگر برخي موارد عفونت دستگاه ادراري در صورت عدم درمان صحيح و به موقع به شرايط وخيمي مانند آسيب شديد كليوي، از كار افتادن كليه هاي بيمار و يا باكتريمي و سپتيسمي كشنده منجر مي شوند. اينها از دلايلي است كه لزوم طراحي يك واكسن مفيد را براي پيشگيري و يا درمان عفونت ادراري نشان مي دهد.

بروسلوز يكي از پنج بيماري شايع باكتريايي مشترك بين انسان و دام (زئونوز) در سراسر جهان بشمار مي آيد. بروسلوز انساني توسط بروسلا مليتنسيس، بروسلا آبورتوس، بروسلا سوييس و بروسلا كانيس ايجاد شده و اين باكتريها پاتوژن انساني بشمار مي آيند. ميزان شيوع جهاني و شدت بيماري حاصل از بروسلا مليتنسيس و آبورتوس بيش از سايرين مي باشد. بروسلوز انساني در تمام نقاط جهان ديده مي شود و بسياري از كشورهاي در حال توسعه از جمله ايران از نظر شيوع بروسلوز اندميك مي باشند. با وجود اهميت بروسلوز و ميزان بالاي شيوع آن در جهان، تلاش ها براي ساخت واكسن ايمن(safe) ومحافظت كننده(protective) جهت ايمن سازي انسان بي نتيجه بوده است. از مهمترين آنتي ژنهاي بروسلايي در طراحي واكسن، پروتئين ريبوزومي L7/L12 از بروسلا آبورتوس و Omp31 از بروسلا مليتنسيس هستند كه داراي خصوصيات ايمونوژنيك و محافظت كننده ميباشند. اندميك بودن ايران براي بروسلوز ، عدم وجود واكسن انساني، افزايش پاسخ ايمني در سيستم چند آنتي ژني و خصوصيت محافظت كنندگي آنتي ژن هاي Omp31 وL7/L12 ، نياز براي توليد واكسن انساني را بسيار ضروري ساخته است. لذا، اختراع حاضر با طراحي يك فيوژن پروتئين نوتركيب حاوي آنتي ژن L7/L12 و فرم كوتاه شده (Truncated) Omp31 به بررسي خصوصيات ايمونوژنيك و محافظت كننده پروتئين فيوژن نوتركيب در برابر عفونت با بروسلا مليتنسيس و آبورتوس پرداخته است.

عفونت دستگاه ادراري شامل عفونت مثانه و كليه از عفونت هاي بسيار شايع در انسان است كه با مرگ و مير قابل توجهي نيز همراه است. اشريشياكلي يوروپاتوژنيك و پروتئوس ميرابيليس دو پاتوژن اصلي ايجاد كننده اين عفونت ها بوده كه به ترتيب با داشتن فاكتورهاي ادهسينيFimH و MrpH در بيماريزايي شركت مي كنند. كانديد واكسنهاي قبلي عليه عفونت ادراري به دلايل مختلف از جمله بي توجهي به نقش سيستم ايمني ذاتي موفق نبوده اند. سيستم ايمني ذاتي از طريق رسپتورهاييبه نام Toll like receptors (TLRs) الگوهاي ميكروبي به نام PAMPsرا شناسايي كرده و باعث فعال شدن سيستم ايمني ذاتي و نيز ايمني اكتسابي عليه عفونت ادراري مي شود. مطالعات امروزي نشان داده است كه حضور TLR4در فعال كردن ايمني ذاتي در دستگاه ادراري ضروري است. امروزه نقش FimH به عنوان يك ليگاند TLR4در فعال كردن ايمني ذاتي و حتي اكتسابي مورد توجه واقع شده است. هدف اصلي ما از اين مطالعه قرار دادن آنتي ژن FimH سويه باكتريايي اشريشياكلي يوروپاتوژنيك در كنار آنتي ژن MrpH از سويه باكتريايي پروتئوس ميرابيليس بومي كشورمان بود تا از طريق فيوژ كردن اين دو پروتيين احتمال فعال شدن سيستم ايمني ذاتي توسط اين دو پروتيين را در يك ملكول واحد مورد بررسي قرار دهيم.پس از مطالعات بيوانفورماتيكي و ساخت فيوژن MrpH.FimH با روش اورلپ PCRو توليد پروتيين در وكتور بياني pET28aارزيابي پاسخهاي ايمني ذاتي اين پروتيين فيوژن روي رده هاي سلول سرطاني مشتق از مثانه و كليه نشان داد كه اين فيوژن قادر است از طريق اتصال به رسپتورهاي TLR4 و با توليد سيتوكينهاي IL-6 و IL-8 تحريك سيستم ايمني ذاتي را انجام دهد. همچنين فيوژن MrpH.FimH در مدل موشي توانست تعداد نوتروفيل ها در ادرار موشها را افزايش شاخصي دهد و نيز پاسخ سيتوكاين هاي IL-6 و IL-8 گروه فيوژن در بافت مثانه و كليه موشها در مقايسه با گروه كنترل به طور شاخصي افزايش يافت. در مجموع در اين مطالعه فيوژن پروتيين MrpH.FimH به عنوان يك ملكول جديد در تحريك سيستم ايمني ذاتي ساخته شد و به خوبي توانست پاسخهاي ايمني ذاتي را در سيستم In Vitro و In Vivo عليه عفونت دستگاه ادراري تحريك كند. همچنين ما براي اولين مرتبهمشاهده كرديم اگرچه ادهسين MrpH نتوانست در سيستم In Vitro پاسخ ايمني ذاتي قابل ملاحظه اي را ايجاد كند ولي قادر بود در محيط In Vivo تحريك قابل ملاحظه اي از ايمني ذاتي داشته باشد. البته در آينده مطالعات ايمنولوژي ديگري نيز روي تركيب MrpH.FimHانجام خواهد شد تا كارايي هاي ديگر اين تركيب عليه عفونت ادراري بررسي شود.

بروسلوز يكي از شايعترين عفونت هاي باكتريايي مشترك بين انسان و دام (زئونوز) در سراسر جهان بشمار مي آيد. اين بيماري توسط گونه هاي جنس بروسلا ايجاد ميگردد بطوريكه ميزان شيوع جهاني و شدت بيماري حاصل از بروسلا مليتنسيس و آبورتوس بيش از سايرين مي باشد. بروسلوز در تمام نقاط جهان ديده مي شود و بسياري از كشورهاي در حال توسعه از جمله ايران از نظر شيوع بروسلوز اندميك مي باشند. در حال حاضر تنها راه كنترل بروسلوز، پيشگيري از انتقال عفونت از دام به انسان است و با وجود تلاش هاي بسيار، ساخت واكسن ايمن ومحافظت كننده جهت ايمن سازي انسان بي نتيجه بوده است. از مهمترين آنتي ژنهاي بروسلايي در طراحي واكسن، پروتئين ريبوزومي L7/L12 از بروسلا آبورتوس و Omp31 از بروسلا مليتنسيس هستند كه طبق مطالعات، داراي خصوصيات ايمونوژنيك و محافظت كننده مي باشند. با توجه به اندميك بودن تمام نقاط كشور ايران براي بروسلوز ، عدم وجود واكسن انساني و خصوصيت محافظت كنندگي آنتي ژن هاي Omp31 وL7/L12، اختراع حاضر با طراحي DNA واكسن و استراتژي Prime-boost بر اساس فيوژن حاوي آنتي ژن L7/L12 و فرم كوتاه شده (Truncated) Omp31 به بررسي و مقايسه خصوصيات ايمونوژنيك و محافظت كننده فيوژن پروتئين تزريق شده توسط دو استراتژي ذكر شده، در برابر عفونت با بروسلا مليتنسيس و آبورتوس پرداخته است.

عفونت دستگاه ادراري جزو عفونت هاي باكتريال شايع در انسان است كه در صورت عدم درمان مناسب مي تواند منجر به عوارض خطرناكي در انسان شود. اشرشياكلي يوروپاتوژنيك و پروتئوس ميرابيليس جزو شايعترين عوامل ايجاد كننده عفونت ادراري پيچيده و غير پيچيده مي باشند. علاوه بر شيوع بالا، افزايش مقاومت آنتي بيوتيكي نياز به يك واكسن ايده آل عليه اين پاتوژن ها را نشان مي دهد. علي رغم تلاش هاي انجام شده تاكنون هيچ واكسن موثري عليه عفونت ادراري در انسان به بازار نيامده است و بنابراين نياز به بررسي آنتي ژنهاي مختلف، مسيرهاي تلقيح و ادجوانت هاي متفاوت شامل ليگاندهاي TLR و همچنين استفاده از تكنولوژي مانند فيوژن پروتيين احساس مي شود. با توجه به نقش ادهسين هاي FimH و MrpH در بيماريزايي سويه هاي اشرشياكلي يوروپاتوژنيك و پروتئوس ميرابيليس و نيز داشتن خصوصيات كانديد واكسن ايده آل، ما در اين بررسي براي اولين مرتبه از اين دو فاكتور بيماريزاي مهم اين دو يوروپاتوژن استفاده كرده و فيوژن پروتيين ساخته شده از اين دو ادهسين را به عنوان يك كانديداي واكسن جديد براي مهار همزمان عفونت ادراري ايجاد شده توسط سويه هاي اشرشياكلي يوروپاتوژنيك و پروتئوس ميرابيليس مورد ارزيابي قرار داديم. از طرفي با توجه به اهميت پاسخ هاي ايمني مخاطي عليه عفونت ادراري در اين مطالعه مسير مخاطي اينترانازال براي ارزيابي واكسن استفاده شد. همچنين با توجه به Safety و قدرت تحريك همزمان پاسخ ايمني از نوع Th1 و Th2 توسط ادجوانت MPL در اين بررسي از اين ادجوانت استفاده شد. در مجموع مطالعه ما پروتيين فيوژن MrpH.FimH همراه ادجوانت MPL را به عنوان بهترين كانديد واكسن عليه عفونت ادراري ايجاد شونده توسط سويه هاي اشرشياكلي يوروپاتوژنيك و پروتئوس ميرابيليس معرفي كرد كه توانست در مرحله پري كلينيكال در فاز حيواني نتايج اميدواركننده اي از خود نشان دهد. البته براي معرفي اين كانديد واكسن مطالعات بيشتري در فاز حيواني بايستي انجام شود كه در صورت موفقيت آميز بودن اين نتايج مي توان ارزيابي كارايي اين كانديد واكسن را در آينده در فاز انساني انجام داد.

بروسلوز يكي از پنج بيماري شايع باكتريايي مشترك بين انسان و دام (زئونوز) در سراسر جهان بشمار مي آيد. بروسلا مليتنسيس، بروسلا آبورتوس، بروسلا سوييس و بروسلا كانيس شايعترين عوامل ايجاد كننده بروسلوز بشمار مي آيند. ميزان شيوع جهاني و شدت بيماري حاصل از بروسلا مليتنسيس و آبورتوس بيش از سايرين مي باشد. بروسلوز در تمام نقاط جهان ديده مي شود و بسياري از كشورهاي در حال توسعه از جمله ايران از نظر شيوع بروسلوز اندميك مي باشند. با توجه به اندميك بودن ايران براي بروسلوز ، عدم وجود واكسن انساني و خصوصيت ايمونوژنيك آنتي ژن Omp2b، اختراع حاضر با استفاده از سه استراتژي طراحي واكسن ضد بروسلا به بررسي ميزان اثربخشي و محافظت ايجاد شده توسط هر يك از اين استراتژي ها و مقايسه آنها با هم پرداخته است. استراتژي هاي مورد استفاده در اين تحقيق شامل: واكسن نوتركيب ،DNA واكسن و سيستم Prime-Boost ميباشند كه با ايميونيزه كردن موش به بررسي خصوصيات ايمونوژنيك و محافظت كننده آنتي ژن بيان شده توسط هر يك از استراتژي هاي ذكر شده در برابر عفونت با بروسلا مليتنسيس و بروسلا آبورتوس پرداخته ايم.

توليد كانديد واكسن ضد بروسلا مليتنسيس و بروسلا آبورتوس براساس پروتئين نوتركيب، DNAواكسن و استراتژي Prime/Boost از فرم كوتاه شده Omp2b "Production of a vaccine candidate against B. melitensis and B. abortus based on truncated Omp2b using recombinant protein, DNA and prime/Boost strategies"