بسمه تعالي خون مصنوعي (همگلوبين كپسوله شده ليپوزومي بر پايه پلي اتيلن اكسايد در مقياس نانو ) زمينه فني اختراع مربوط بشر از دير باز در پي يافتن جايگزيني براي خون بوده و در همين راستا از موادي همچون شير، صمغ و هموليزات گلبول قرمز نيز به صورت تزريق داخل رگي استفاده مي‌نموده است. كلمه جايگزين خون اولين بار براي افزايش دهنده هاي حجم پلاسما (plasma expanders) و سپس براي جايگزين‌هاي فرآورده هاي خوني استفاده گرديده است. امروزه اين واژه به مواد درماني اطلاق مي‌گردد كه در خارج از بدن تهيه گرديده و داراي اين توانايي مي‌باشند كه به جاي خون مصرف گرديده و ميزان نياز به تزريق خون را كاهش دهند. اگر اين مواد داراي توانايي تقليد عملكرد فرآورده خوني باشند به آن‌ها جايگزين‌هاي واقعي خون (red blood substitute) گفته مي‌شود. آن دسته از اين مواد كه باعث كاهش نياز به تزريق خون به وسيله تقويت توليد آن فرآورده مورد نياز در بدن مي‌گردند ( مانند اريتروپويتين، G-CSF ، ترومبوپويتين ، اينترلوكين¬ها وDDAVP ) به عنوان جايگزين خون حقيقي (virtual blood substitute) شناخته مي‌شوند. حتي بعضي افراد بر اين اعتقاد هستند كه در آينده سلول‌هاي بنيادي (stem cell) كه در محيط آزمايشگاهي فعال گرديده‌اند و ژن درماني نيز مي‌توانند به عنوان جايگزين‌هاي خون مطرح گردند. در كل جايگزين‌هاي خون به موادي گفته مي‌شوند كه علاوه بر افزايش حجم خون توانايي حمل و نقل اكسيژن را نيز داشته باشند . از ميان جايگزين‌هاي واقعي خون بيشتر از همه دو فرآورده جايگزين‌هاي RBC و پلاكت مورد بررسي و مطالعه قرار گرفته¬اند. علت ضرورت نياز به جايگزين خون : 1. با پيشرفت‌هاي سريع روش‌هاي جراحي و علي‌الخصوص افزايش درمان‌هاي سرطان توسط پروتكل‌هاي درماني اگرسيو نياز به تزريق RBC و پلاكت در سال‌هاي اخير از ميزان توليد آن توسط منابع انساني بيشتر شده است. بنابراين استفاده از جايگزين‌هاي خون وجهت كاهش فاصله موجود بين عرضه و تقاضا ضروري مي‌باشد. 2. ريسك انتقال عفونت‌هاي قابل انتقال از طريق تزريق خون (T.T.I) مانند HIV ، HBV ،HCV، مالاريا، سفليس، nvCJD، CMV و غيره در سال‌هاي اخير بسيار مورد توجه قرار گرفته است . اگرچه قوانين اجباري اسكرينينگ قبل از تزريق خون‌هاي آلوژن به ميزان بسيار قابل توجهي ريسك انتقال عفونت را كاهش داده است ولي هنوز هيچ كدام از فرآورده هاي توليدي كاملاً بدون خطر نمي‌باشد. به علاوه هيچ‌گاه هيچ تضميني وجود ندارد كه عوامل عفوني جديد و نوظهور در خون كشف نگردد. در اين زمينه نيز با توجه به اينكه جايگزين‌هاي خون مراحل بسيار سخت استريليزاسيون آزمايشگاهي را طي مي‌نمايند استفاده از اين نوع مواد مي‌تواند به ميزان قابل توجهي ريسك انتقال عفونت و هزينه هاي مربوطه را كاهش دهد. لازم به ذكر است كه هزينه تهيه و تزريق هر واحد خون در كشورهاي غربي بين 200 تا 250 دلار مي‌باشد. 3. در مواقعي كه به طور ناگهاني نياز به تزريق خون به ميزان زياد وجود دارد مانند تصادفات ، بلاياي طبيعي ، جنگ و غيره معمولاً دستيابي به خون آلوژن كافي در همان لحظه ممكن نبوده و استفاده از جايگزين‌هاي خون مي‌تواند نجات دهنده جان بيماران باشد. 4. تزريق خون آلوژن همواره داراي ريسك‌هاي ايموژنيك مانند واكنش‌هاي ناسازگاري ، GVHD، واكنش‌هاي آلرژيك و تب زا ، TRALI و ... مي‌باشد كه اگر چه اخيراً بسيار كاهش يافته ولي كاملاً از بين نرفته است . به علاوه هزينه يافتن اهدا كننده مناسب و خون گيري ، حمل و نقل خون ، نگهداري خون در دماي مناسب، انجام تست سازگاري ، كاهش لكوسيت خون ، اشعه دادن به خون و تكنيك‌هاي ديگر آماده سازي خون بسيار زياد مي‌باشد. اين در حالي است كه جايگزين‌هاي خون فاقد ماركرهاي ايمونوژن بوده و توانايي كاهش عوارض فوق‌الذكر را دارند. 5. طول عمر نگهداري (shelf life) خون آلوژن كوتاه بوده و همين مسئله باعث مي‌گردد كه با پايان تاريخ انقضا خون‌هاي مصرف نشده ميزان ضايعات خون افزايش يابد. در عوض جايگزين‌هاي خون داراي طول عمر نگهداري بسيار طولاني‌تر بوده و حتي در موارد ليوفليزه تا چندين سال قابل نگهداري مي‌باشند. 6. برخي از انسان‌ها و گروه‌هاي اجتماعي به دليل عقايد مذهبي خاص (مانند Jahova Witnesses) از دريافت خون و فرآورده هاي خوني انسان‌هاي ديگر منع گرديده و ممانعت مي‌نمايند. گاهي اوقات تنها جايگزين درماني اين افراد مي‌تواند استفاده از جايگزين‌هاي خون باشد . مشكل فني و بيان اهداف از مشكلات و معايب اين نوع هموگلوبين پاكسازي سريع آن از جريان خون توسط سلول هاي رتيكولواندوتليال مي‌باشد كه باعث كاهش طول عمر آن‌ها به چند ساعت مي‌گردد. مطالعات نشان داده كه حذف سياليك اسيد سطح غشا اين گويچه ها باعث افزايش سرعت پاكسازي آن‌ها از خون مي‌گردد. بنابراين در تركيبات جديد پلي ساكاريد غني از سياليك اسيد و داراي بار منفي سطحي به سطح غشا اضافه گرديده كه خود باعث افزايش زمان سيركولاسيون هموگلوبين كپسوله در خون مي‌گردد. هدف از انجام اين اختراع دستيابي به جايگزيني براي خون (خون مصنوعي) با قابليت انتقال بيشتر اكسيژن به بافت‌هاي آسيب ديده از جمله بافت هاي دچار ايسكمي در مواقع بحراني مي¬باشد. استفاده از فناوري نانوبيو جهت ساخت سامانه¬هاي نانويي كه حمل كننده هموگلوبين مي¬باشند و موجب افزايش قابل توجه انتقال اكسيژن به بافت¬ها مي¬باشند. د ) شرح وضعيت دانش پيشين و سابقه پيشرفت هايي كه در ارتباط با اختراع ادعايي وجود دارد. تاكنون طرحي ، در زمينه خون مصنوعي در ايران صورت نگرفته است. اولين تلاش براي كپسول دار كردن هموگلوبين توسط غشاهاي مصنوعي جهت مشابه سازي گلبول قرمز در سال 1957 گزارش گرديده است. هموگلوبين كپسول دار به فرم تترامريك بوده و داراي نمودار تجزيه اكسيژن مشابه گلبول قرمز طبيعي مي‌باشد. اين غشا مانع تجزيه هموگلوبين به فرم دايمر ميگردد تركيبات ليپوزومي كه در ساخت غشا اين نوع هموگلوبين مورد استفاده قرار مي گيرد عبارتند از كلسترول، فسفوليپيد و گانگليوزيد و آنزيم‌هاي ديگر مانند كربنيك انيدراز و كاتالاز را نيز مي توان به داخل كپسول حاوي همگلوبين اضافه نمود. مطالعات اوليه در حيوانات نشان داده كه از اين نوع هموگلوبين به خوبي مي توان در درمان خونريزي¬هاي شديد استفاده نمود و پس از تزريقات مكرر نيز هيچگونه عارضه پاتولوژيك در بافت¬هاي بدن از جمله مغز، قلب، كليه و ريه نيز ايجاد ننموده است. هـ) ارائه راه حل براي مشكل فني موجود همراه با شرح دقيق. به اين منظور با استفاده از فناوري نانوبيو مي¬توان تركيب و بار سطحي ليپوزوم¬هاي حاوي همگلوبين را طوري تعيين كرد كه كمترين برهمكنش را با سيستم ايمني بدن ايجاد نمايد و در واقع پتانسيل زتا آن به صفر نزديك باشد . در فرمولاسيون تركيب ليپوزوم مورد استفاده در اين اختراع، از كلسترول و فسفاتيديل كولين استفاده شده است كه در محيطي با pH حدود 4/7 بار سطحي آن نزديك به صفر مي-باشد. و ) بيان واضح و دقيق مزاياي اختراع ادعايي. 1.\\tداشتن ظرفيت بالاي انتقال اكسيژن و دي اكسيد كربن 2.\\tتبادل گازهاي تنفسي در حد فيزيولوژيك 3.\\tنيمه عمر داخل عروقي مناسب، فشار اسمزي و انكوتيك معادل خون 4.\\tعدم انتقال عفونت و عدم ايجاد واكنش ايمني 5.\\tقابل دسترس 6.\\tداراي هزينه توليد كم و مقرون به صرفه 7.\\tاين نوع خون در جريان خون و در داخل رگ به فرم دايمر شكسته نگرديده و در نتيجه فاقد سميت كليوي بوده و به سلول‌هاي اندوتليال عروق نيز صدمه نمي رساند. به علاوه به دليل عدم اتصال اكسيد نيتروژن(NO) ايجاد هيپرتانسيون و اسپاسم مري نيز نمي نمايد. ز ) ذكر صريح كاربرد. 1.\\tروشي نوين براي درمان ايسكمي بافتي 2.\\tروشي نوين براي خون رساني به بافت مورد نظر 3.\\tبا توجه به اينكه در حال حاضر موارد مصرف جايگزين¬هاي خون تنها محدود به مواقع اورژانس، درمان سريع شوك هموراژيك، رقيق نمودن خون قبل از جراحي Bypass قلبي عروقي و آنژيوپلاستي توسط بالن بوده و در واقع جايگزين خون به عنوان واسطه¬اي جهت فراهم نمودن زمان لازم براي تهيه و تزريق خون آلوژن عمل مي¬نمايد. 4.\\tبازگرداندن اكسيژن رساني به حالت اول پس از دست رفتن خون به علت آسيب در مواقع اورژانسي و ميدان جنگ. 5.\\tجلوگيري از نياز به تزريق خون در حين اعمال جراحي 6.\\tنگه داري از جريان اكسيژن به بافت‌هاي سرطاني كه ممكن است بتواند شيمي درماني را مؤثرتر كند. 7.\\tدرمان كم خوني كه موجب كاهش گلبول‌هاي قرمز خون مي‌شود. 8.\\tامكان اكسيژن رساني به بافت‌هاي متورم يا نواحي از بدن كه تحت تأثير كم خوني داسي شكل قرار گرفته‌اند. ح ) توضيح حداقل يك روش اجرايي براي به كارگيري اختراع. يكي از كاربردهاي تحقق اين امر درمان ايسكمي هاي بافتي مي‌باشد از كاربردهاي ديگر آن كنترل سرعت اكسيژن رساني به يك بافت مي‌باشد. خلاصه اي از توصيف اختراع: در اين اختراع از فناوري نانوليپوزوم براي كپسول دار كردن همگلوبين به عنوان خون مصنوعي استفاده شده است . از آنجا كه ميزان جذب اكسيژن و دي اكسيد كربن توسط اين محلول برابر با همين ميزان در خون واقعي ، ميتواند به عنوان جايگزيني براي خون در مواقع بحراني از آن استفاده نمود. بسمه تعالي ادعا نامه: اينجانبان: قاسم عموعابديني فرزند حسن متولد 1344 به شماره شناسنامه 920 صادره از تهران و ساكن تهران، آرش رمداني فرزند ولي متولد 1367 به شماره شناسنامه 13025 صادره از همدان و ساكن تهران هادي تابش فرزند محمدرضا متولد 1358 به شماره شناسنامه 62421 صادره از اصفهان و ساكن تهران، مدعي هستيم: كه اين اختراع\\\\\\" خون مصنوعي (همگلوبين كپسوله شده ليپوزومي در مقياس نانو بر پايه پلي اتيلن اكسايد)\\\\\\" براي اولين بار طراحي و نمونه داخلي و خارجي ندارد. اجزا دستگاه و شرح فرآيند: مواد مورد نياز براي تهيه نانوليپوزوم¬هاي همگلوبين به شرح زير است : o\\tدي پالميتوئيل فسفاتيديل كولين o\\tكلسترول o\\tپلي اتيلن اكسايد o\\tنمك فسفات o\\tكلروفرم o\\tهمگلوبين گاوي o\\tآب ديونيزه تجهيزات مورد نياز عبرتند از : o\\tهيتراستيرر o\\tروتاري o\\tپمپ خلا o\\tبالن ته گرد o\\tهموژنايزر o\\tpH متر o\\tدستگاه انجماد خشك در اين قسمت روند تهيه محلول‌ها و روند انجام مراحل شرح داده شده است. تهيه محلول بافرآبي نمك فسفات خريداري شده از شركت سيگما داراي 10 بسته نمك فسفات بود كه از اختلاط يك بسته نمك فسفات در 1 ليتر آب ديونيزه محلول بافرآبي با pH برابر با 4/7 حاصل شد. براي انحلال كامل نمك فسفات درون آب ديونيزه محتويات ارلن توسط يك مگنت مغناطيسي هم زده شد. اين كار به منظور تهيه‌ي محلول بافر با PH برابر با 4/7 به عنوان محيط آبي‌بافري براي تهيه‌ي ليپوزوم‌ها انجام شد. تهيه محلول همگلوبين مراحل اصلي براي تهبه محلول همگلوبين شرح زير است : 1.\\tسترون كردن تمامي ظروفي كه براي آماده سازي همگلوبين كپسوله شده ليپوزومي استفاده مي‌شود از جمله لوله هاي سانترفيوژ 2.\\tتوزين 6 گرم همگلوبين و انحلال آن در 100 ميلي ليتر محلول فسفات بافر سالين 3.\\tبراي افزايش pH محلول همگلوبين از 6.6 به 7.4 آن را در محلول فسفات بافر سالين(0.01 مولار , pH = 7.4) حل مي نماييم و همچنين براي افزايش تعادل اسمزي پلاسماي خون 4.\\tاضافه كردن آنتي بيوتيك ها براي مهار رشد باكتري ها كه مقادير مورد استفاده آن در هر ليتر از محلول همگلوبين به شرح زير است : Pencillin-50,000 units; Streptomycin -50 mg; Gentamycin-40 mg 5.\\tافزودن آنتي اكسيدان Glutathione به محلول همگلوبين : Glutathione واكنش همگلوبين با راديكال هاي آزاد را كاهش مي دهد و به اين ترتيب سرعت تشكيل methemoglobin (metHb) را در طول ذخيره سازي كاهش مي دهد. 6.\\tاضافه كردن انيدريد كربنيك به محلول همگلوبين به ميزان 2.5 ميلي گرم بر ميلي ليتر تا به سطح مشابه گلبول قرمز خون برسد. اضافه كردن انيدريد كربنيك اين اطمينان را براي كنترل انتقال جرم CO2 در in vivo ايجاد مي كند. 7.\\tسانترفيوژ محلول همگلوبين در (33000 Xg) (15,000 rpm) به مدت 30 دقيقه در دماي 4 درجه سانتيگراد به منظور حدف رسوبات احتمالي شكل گرفته ( دماي 4 درجه سانتي گراد به منظور پايين نگه داشتن سطح metHb مي باشد. فرآيند پس از شستشوي بالن ته گرد و بشرها با آب و مايع ظرفشويي و چندين بار شستشو با آب مقطر، ارلن درون آون در دماي 121 درجه‌سانتيگراد قرار گرفت تا از هرگونه آلودگي كه بتواند در اندازه نانوليپوزوم‌هاي تهيه شده اثرگذار باشد جلوگيري شود. پس از بيرون آوردن ارلن از درون آون براي خنك شدن آن به مدت 15 دقيقه زمان سپري ‌شد. در اين مرحله بعد از توزين تركيب فسفوليپيد طبق جدول زير درون بشر 40 ميلي‌ليتر كلروفرم توسط استوانه مدرج ريخته شد. وزيكول هاي ليپوزومي با انحلال مخلوط ليپيدهايي كه در جدول زير آمده است در حلال كلروفرم در دماي اتاق بدست مي آيد پس از انحلال , محلول حاصل را در روتاري (rotary evaporator) ريخته و حلال را تحت خلا نسبي تبخير مي نماييم تا فيلم ليپوزومي در ته بالن ته نشين گردد. سپس محلول هموگلوبين به فيلم ليپوزومي اضافه شده و به حالت تعليق در مي آيد. براي كاهش اندازه وزيكول هاي همگلوبين كپسوله شده ليپوزومي را چندين بار از طريق سيستم هموژنايزر اكستروژن مينماييم. سپس همگلوبين كپسوله شده ليپوزومي را سه بار در محلول ايزوتونيك نمك فسفات شسته و پس از هر بار شستشو در سانترفيوژ 15000 XG به مدت 20 دقيقه در دماي 4 درجه سانتيگراد قرار مي دهيم . هدف از اين روش شستشو اطمينان از حذف كامل تمام باقي مانده حلال آلي در صورت وجود و حذف پروتئين هاي هموگلوبين از فاز بيروني غشا ليپوزوم مي¬باشد. ليپوزوم ها شسته شده و در ايزوتونيك نمك فسفات پراكنده شدند. در اين مرحله همگلوبين كپسوله شده ليپوزومي آماده براي استفاده در مطالعات تجربي مي باشد. در مرحله‌ي بعد جذب مولكول‌هاي پلي اتيلن اكسايد با قرار دادن همگلوبين كپسوله شده ليپوزومي در انكوباتور به مدت 24 ساعت و در حضور حجم مساوي از نانو ذرات و محلول پوشش دهي پلي اتيلن اكسايد مربوطه صورت مي‌گيرد. ويژگي هاي اختراع: \\tداشتن ظرفيت بالاي انتقال اكسيژن و دي اكسيد كربن \\tتبادل گازهاي تنفسي در حد فيزيولوژيك \\tنيمه عمر داخل عروقي مناسب، فشار اسمزي و انكوتيك معادل خون \\tعدم انتقال عفونت و عدم ايجاد واكنش ايمني \\tقابل دسترس \\tداراي هزينه توليد كم و مقرون به صرفه \\tاين نوع خون در جريان خون و در داخل رگ به فرم دايمر شكسته نگرديده و در نتيجه فاقد سميت كليوي بوده و به سلول‌هاي اندوتليال عروق نيز صدمه نمي رساند. به علاوه به دليل عدم اتصال اكسيد نيتروژن(NO) ايجاد هيپرتانسيون و اسپاسم مري نيز نمي نمايد.

در اين اختراع براي بدست آوردن مقاومت انتقال جرم در غشاهاي الياف توخالي دبي گاز عبوري بوسيله تبادل گر حاضر اندازه گيري شده است. در اين اختراع براي اندازه گيري دقيق انتقال جرم گاز در غشاهاي الياف توخالي متخلخل و ريز متخلخل با اندازه گيري ميزان گاز عبوري از الياف با ستون مايع و در نتيجه دبي گاز عبوري بر حسب زمان اندازه گيري مي شود با اين دستگاه مي توان مقاومت انتقال جرم را براي غشاهاي الياف توخالي در تبادل گرهاي گاز-گاز بدست آورد. از آنجا كه بخش عمده اي از مقاومت انتقال جرم در تبادلگرهاي مايع-گاز ازجمله ريه مصنوعي به فاز مايع(بعد از عبور گاز از غشا) مربوط مي شود. با استفاده از اين تبادلگر گاز گاز مي توان مقاومت دقيق غشا را در ريه مصنوعي محاسبه كرد..

‏پخش كننده منحصر بفرد ريه مصنوعي داراي قابليت بالا در حفظ خون از صدمات ناشي از فشارهاي احتمالي در مسير پخش مي باشد. زمينه فني اختراع، علوم زيستي، مهندسي پزشكي و اندام هاي مصنوعي است. ‏در حال حاضر بعلت عدم تقارن و پيچيدگي مسير پخش خون در نمونه هاي موجود، امكان تحليل سيالاتي و پيش بيني عملكرد پخش كننده با دقت بالا وجود ندارد. هندسه متقارن و تا حد امكان ساده ي طراحي پخش كننده اين امكان را براي ما فراهم مي كند. ‏دستگاه ريه مصنوعي براي جانبازان شيميايي، بيماران داراي مشكل حاد ريوي، نوزادان نارس و عمل هاي جراحي قلب باز دستگاه حياتي بشمار مي رود و يكي از مهمترين بخش هاي ريه مصنوعي پخش كننده ي آن مي باشد. پخش كننده قابل بسط در سيستم هاي كليه مصنوعي كبد مصنوعي و بيوراكتورهاي كشت سلولي، براي پخش يكنواخت خون يا هر سيال ديگر مي باشد.