بيماري رايزومونيا يكي از مخرب¬ترين بيماري¬هاي چغندرقند در مناطق زير سطح كشت كشور است كه توسط ويروس Beet necrotic yellow vein virus (BNYVV) ايجاد ميشود. روش¬هاي سنتي كنترل از قبيل سادرن¬بلات و وسترن ¬بلات نيز به ترتيب جهت شناسايي قطعات DNA و پروتئين اختصاصي، قابليت محدودي در شناسايي اين بيماري دارند. بنابراين استفاده از تكنولوژي¬هاي نوين براي تشخيص به موقع بيماري جهت كاهش خسارات پيش رو مي¬بايد در نظر گرفته شود. \\\\\\\\\\\\\\"نانو كيت تشخيص Polymyxa betae، ناقل عامل بيماري ريشه¬گنايي چغندرقند با بازدهي بالا \\\\\\\\\\\\\\" كيت تشخيصي بر پايه علم نانوبيوتكنولوژي جهت رديابي موثر، دقيق، سريع و ارزان عامل بيماري مي باشد. در كيت توليد شده سعي گرديده است ضمن حل تمام مشكلات موجود در مسير شناسايي عامل بيماري به ارائه يك روش كاملا جديد و منطبق بر اصول علمي مبادرت گردد. در اين سيستم سامانه تشخيصي از نقاط كوانتومي پوشيده شده با آنتي باديهاي پلي¬كلونال كه در حالت هم¬پوشاني با Rhodamin متصل به آنتي ژن GST هستند تشكيل شده است. Rhodamin متصل به آنتي ژن GST نقش گيرنده و نقاط كوانتومي متصل به آنتي باديهاي پلي كلونال در نقش دهنده انرژي را دارند. هنگام اضافه كردن آنتي ژن GST خالص (مثلا موجود در عصاره ريشه گياه مشكوك به آلودگي) به محلول قبلي عمل جايگزيني آنتي ژن GST خالص به جاي آنتي ژن GST متصل به Rhodamin صورت گرفته و اثر هم پوشاني بين گيرنده و دهنده برداشته شده و نمودارهاي نشري به سطوح پايين¬تر جابه¬جا مي¬شوند. اين اختراع در واقع امكان تشخيص عامل بيماري در غلظت¬هاي پايين عصاره آلوده را فراهم آورده است.

چغندرقند يكي از مهم¬ترين گياهان زراعي مي¬باشد كه اصلي¬ترين ماده اوليه جهت توليد قند و شكر در كشور مي-باشد. بيماري رايزومونيا به عنوان مهم¬ترين بيماري ويروسي چغندرقند در ايران شناخته شده است. قارچ Polymyxa betae به عنوان تنها ناقل طبيعي اين بيماري نقش كليدي در انتقال ويروس Beet nectotic yellow vein virus(BNYVV) دارد. با توجه به محدود بودن منابع مقاومت به بيماري رايزومونيا كه عمدتاً از ‍‍ژنهاي مقاومت به ويروس BNYVV استفاده مي¬شود، ارزيابي¬هائي جهت تعيين ژرم¬پلاسم¬هاي مقاوم به اين قارچ ضروري مي¬باشد. با توجه به عدم قابليت كشت قارچ مذكور، ايجاد يك سيستم تشخيصي مناسب جهت شناسائي نمونه هاي آلوده براي انجام مطالعات اپيدميولوژي و همچنين تعيين منابع مقاومت ضروري ميباشد. پروتئين (GST) glutathione-S-transferase به ميزان بالا درقارچ توليد ميشود و ميتوان از آن به عنوان معياري در جهت شناسائي نمونه هاي آلوده استفاده نمود. در اين پروژه از تكنولوژي نانوبيوسنسور متصل به آنتي بادي جهت شناسايي نمونه هاي آلوده استفاده ميشود. نقاط كوانتومي Quantum dots، نانو¬ذراتي با خصوصيات منحصر به فرد هستند كه كاربردهاي بالقوه¬اي در علوم زيستي و مشاهده وقايع درون سلول دارند. اين نانو¬ذرات، عموماً نيمه¬هادي¬هايي از جنس سلنيد¬كادميم بوده كه به وسيله يك پوسته نيمه¬هادي ديگر از جنس سولفيد¬روي پوشيده شده¬اند و توانايي نشر نورهايي با رنگ¬هاي مختلف را دارند، كه رنگ نور به اندازه كريستال آن¬ها بستگي دارد .مولكول¬هايي نظير آنتي¬بادي¬ها و يا رشته¬هاي DNA مي¬توانند به اين لايه پليمري متصل شوندو به اين صورت مي¬توان از آن¬ها براي شناسايي و رديابي پروتئين هاي خاص از آن استفاده كرد. در اين تحقيق، ژن كد كننده پروتئين GST از نمونه هاي آلوده جداسازي گرديده و پس از بيان در ميزبان باكتريايي و خالص سازي بر روي ستون كروماتوگرافي از آن به عنوان آنتي ژن جهت توليد آنتي بادي اختصاصي بر عليه قارچ استفاده ميگردد. خالص سازي آنتي بادي بر روي ستون پروتئين A صورت پذيرفته و از آن براي اتصال به ذرات ¬كوانتومي QD استفاده ميگردد و از سيستم شناسايي مبتني بر اساس FRET براي تاييد وجود آلودگي استفاده ميگردد. تا به حال گزارشي از تهيه اين تركيب براي شناسايي اين قارچ ارائه نشده است.

خلاصه‌اي از توصيف اختراع؛ با ارائه روش كشت در بستر يكپارچه و پيشرفته، يكي از مشكلات بسيار مهم و اوليه كشت بافت مرتفع مي شود. نوآوري آن در كم كردن هزينه ها، سرعت بالاي استريل نمونه گياهي، شستشو و تزريق محيط كشت و همچنين كنترل و مديريت عوامل آلودگي است. اين سيستم بصورت يكپارچه و پيوسته مي باشد. به همين دليل بدون نياز به ظرفها و وسايل استريل گوناگون، تنها با يك بستر يكپارچه مي توان تمام فرايندهاي ذكر شده را يكجا انجام داد. ايزوله كردن هر نمونه گياهي از نمونه هاي كناري آن، يا بعبارتي قرنطينه كردن آنها در فضاي محدود، فرصتي ايجاد مي نمايد تا نمونه ها جدا از هم و بصورت كاملا مجزا، مونيتور شوند. چنين نوآوري باعث مديريت و كنترل دقيق آلودگيها مي شود. علاوه بر اين، مرحله وقت گير كشت تك تك بذرها در پتري ديش يا لوله آزمايش حذف مي شود و تمام نمونه ها، بدون جابجايي به ظرف ديگر، به فيتوترون منتقل مي شوند. همچنين مي توان با اين روش در سطح بسيار وسيعتر، اقدام به كشت بافت گياهي در فضاهاي محدود كرد و بطور چشمگير و معني داري، در هزينه هاي مواد كشت بافتي، هزينه هاي كارگري، فضا و عمليات كشت بافت صرفه جويي كرد.

ويروس تريستزا يكي ازمهمترين عوامل بيماريزاي مركبات در دنيا به شمار مي‌رود. امروزه روش‌هاي نوين مبتني بر مهندسي آنتي بادي به عنوان راهكاري جديد در شناسايي گياهان آلوده مورد استفاده قرار مي‌گيرد. يكي از ابزار‌هاي مهم در توليد آنتي بادي‌هاي نوتركيب استفاده از تكنولوژي نمايش فاژي مي‌باشد كه در اين سيستم توليد و جدا سازي فاژهاي اختصاصي نوتركيب با قابليت اتصال به ويروس و يا پروتئين ايجاد مي شوند. در اين فرايند از كتابخانه فاژي حاوي ژن‌هاي آنتي بادي انساني به منظور توليد فاژ‌هاي نوتركيب حاوي قطعات آنتي بادي اختصاصي بر عليه ويروس تريستزاي مركبات استفاده شد. براي اين منظور، توليد و خالص سازي پروتئين پوششي ويروس تريستزا به صورت نوتركيب در باكتري انجام شد. براي ‌اين منظور از سازه بياني حاوي ژن كد كننده پروتئين پوششي CTV استفاده گرديد. ژن پروتئين پوششي ويروس از نمونه گياهي آلوده به CTV جمع آوري شده از منطقه ساري جدا سازي شده بود. غني سازي كتابخانه فاژي با انجام مراحل غربال گري صورت گرفت و قابليت اتصال جمعيت‌هاي اختصاصي فاژ‌ها با استفاده از آزمون‌هاي سرولوژيك بررسي شد. استفاده از فرايند مذكور با انجام سه دور‌ متوالي بيوپنينگ كتابخانه فاژي، منجر به افزايش اختصاصيت فاژها شد و فاژهاي جدا شده اختصاصيت بالايي در اتصال به پروتئين پوششي ويروس و همچنين نمونه هاي گياهي آلوده داشتند.

بيماري تريستزاي مركبات يكي از مخرب ترين بيماري‌هاي مركبات در كشور مي باشد. امروزه استفاده از كيت‌هاي تشخيصي به منظور رديابي اين بيماري در باغات جهت جلوگيري از گسترش بيماري و توليد نهال‌هاي عاري از ويروس اهميت به سزايي دارد. اختراع حاضر شامل فرايند جديد توليد كيت تشخيصي به منظور شناسايي بيماري تريستزاي مركبات با استفاده از فناوري پروتئين نوتركيب و آنزيم پراكسيداز مي باشد. براي ‌اين منظور توليد پروتئين پوششي ويروس ابتدا به صورت نوتركيب در سلول باكتري انجام مي گردد. پس از انجام خالص سازي از اين پروتئين براي‌ايمني‌زايي خرگوش و توليد آنتي‌بادي چند همسانه‌اي اختصاصي ويروس تريستزا استفاده مي شود. خالص سازي‌ايمونوگلوبولين از سرم انجام گرفته و سپس نشاندار نمودن آن با آنزيم پراكسيداز صورت مي گيرد. شناسايي نمونه هاي گياهي آلوده با استفاده از آنتي بادي و كانژوگه تهيه شده در اين فرايند با روش اليزا صورت مي پذيرد. نتايج حاصله حاكي از كاركرد موثر و دقيق اين فرايند براي شناسايي بيماري تريستزا در نمونه هاي گياهي مي باشد.

‏بيماري جاروك ليمو ترش يكي از مخربترين بيماريهاي ليموترش در مناطق گرم جنوبي كشور مي باشد كه هزاران درخت را ساليانه در اين مناطق نابود مي كند‏. با توجه به عدم دسترسي به روش كنترلي مناسب بر عليه اين بيماري و همچنين با توجه به اينكه اين بيماري در حال حاضر محدود به نواحي جنوبي كشور بوده، امحاء كانون هاي آلودگي و جلوگيري از حمل و نقل مواد گياهي آلوده از جمله مهمترين اقدامات در دست اجراي وزارت كشاورزي و ساير نهاد هاي ذيربط در اين مسئله ميباشد. بنابراين دسترسي به يك روش تشخيص با دقت و حساسيت بالا كه قابليت انجام در مناطق دورافتاده ‏و با حد اقل امكانات را دارا باشد از جمله مهمترين نياز هاي اوليه در اين خصوص ميباشد. در اينجا كيت سرولوژي DAS-ELISA ‏جهت تشخيص دقيق و سريع نمونه هاي آلوده توليد گرديده است كه قابليت استفاده در آزمايشگاه هايي با حداقل ‏امكانات را دارا ميباشد. در اين تحقيق پروتئين Imiliunodominant ‏( membrane protein (IMP ‏ موجود در سطح غشا فيتوپلاسما به عنوان هدف جهت شناسائي اين بيماري انتخاب گرديده است. با استفاده از منابع اطلاعاتي ژنتيكي در ابتدا پرايمر هاي اختصاصي ژن IMP ‏ طراحي گرديد و جداسازي ژن مربوطه از گياهان آلوده صورت پذيرفته و جهت توليد انبوه بصورت نوتركيب، در ناقل بياني باكترياثي p.ET28 ‏ همسانه سازي گرديد. بيان پروتئين نوتركيب IMP ‏ در ميزان زياد در استرين BL21-de3 ‏ باكتري E. coli ‏ انجام گرديد و خالص سازي پروتئين مربوطه در شرايط طبيعي با روش كروماتوگرافي تمايلي در ستون هاي حاوي رزين (Ni-NTA ‏) انجام شد. بيان موفق و مراحل خالص سازي بوسيله SDS-PAGE ‏ و سپس آناليز وسترن بلات تاييد گرديد. پروتئين نوتركيب خالص IMP ‏براي انجام ايمني زائي در خرگوش استفاده گرديد. تزريق ها بصورت هفتگي ادامه يافته و پس از هر تزريق عيار آنتي بادي هاي اختصاصي تعيين گرديد. هنگامي كه عيار آنتي بادي هاي اختصاصي به حد مطلوب رسيد، خونگيري از خرگوش انجام گرفته و سپس سرم خون جداسازي گرديد. بر اساس آزمون هاي تعيين تيتر، آخرين تيتر آنتي ‏بادي كه با آنتي ژن مربوطه واكنش اختصاصي ايجاد نمود در حد 6۵۵٣6 ‏تعيين گرديد. ازمون تكميلي وسترن با پلاتينگ جهت تاييد اختصاصيت آنتي بادي هاي حاصله صورت گرفت كه نتاج حاصله حاكي از انجام واكنش اختصاصي با نمونه هاي آلوده بود. جهت ساخت كيت سرولوژيكي تشخيص DAS-ELISA ‏ ابتدا آنتي بادي هاي موجود در سرم خون با استفاده از از ستون پروتئين A ‏ خالص سازي گرديد و پس از تاييد خلوص و تعيين غلغلت جه اتصال به آنزيم آلكالين فسفاتاز مورد استفاده قرار گرفت و براي استفاده در سيستم تشخيص DAS-ELISA ‏ مورد استفاده قرار گرفت. نتايج حاصله از اين آزمايش قابليت كيت سوولوژيكي موبوطه را جهت شناسائي نمونه هاي آلوده گياهي تاييد نمود.

نانو كيت تشخيص عامل بيماري جاروك ليموترش با ارائه يك سيستم بسيار دقيق و كارا همراه با به كارگيري فن آوري مبتني بر دانش نانوتكنولوژي و مهندسي ساخت و استفاده از آنتي بادي هاي پلي كلونال به عنوان شناساگرهاي اختصاصي تشخيص سريع دقيق و ارزان عامل بيماري جاروك ليموترش را در درختان مشكوك به آلودگي فراهم آورد.

‏بيماري ريزومونيا توسط ويروس ( Beet necrotic yellow vein virus 5 (BNYVV ‏ايجاد ميگردد و بعنوان مهمترين بيماري ويروسي چغندر قند در ايران شناخته شده است كه همه ساله خسارات قابل توجهي به ‏مزارع چغندر قند كشور وارد مينمايد. تنها ناقل ‏طبيعي ويروس عامل بيماري، قارچ Polymyxa betae ‏ميباشد. ‏نبود سيستم تشخيص سرولوژيك مشخص براي شناسائي قارچ P. betae ‏در نمونه هاي آلوده، همواره انجام ‏مطالعات كيفي و كمي اين قارچ را با مشكلات زيادي همراه كرده است. تا به حال بررسي آلودگي نمونه هاي ‏گياهي به قارچ P. betae ‏براساس روش هاي مبتني بر رنگ آميزي و مشاهدات ميكروسكوپي و يا روش هاي ‏مولكولي از قبيل PCR ‏انجام پذيرفته است. با توجه به شكلات موجود از ‏جمله فقدان ارزيابي كمي در آنها و ‏همچنين عدم توانايي تعيين زنده يا مرده بودن پاتوژن مورد نظر، دسترسي به يك روش تشخيصي با دقت و ‏حساسيت بالا جهت شناسايي و رديابي اين شبه قارچ در بافت گياه آلوده كه قاپلپت انجام در مناطق دور افتاده و پا ‏حداقل امكانات را دارا باشد از جمله مهمترين نياز هاي اوليه در اين خصوص ميباشد. در اينجا كيت سرولوژي DAS-ELISA جهت تشخيص دقيق و سريع نمونه هاي آلوده توليد گرديده است كه قابليت استفاده در ‏آزمايشگاه هايي با حداقل ‏امكانات را دارا مي باشد.

تمامي روشهاي رايج كنوني مورد استفاده جهت تشخيص عامل بيماري جاروك ليمو ترش داراي معايب و محدوديت هاي زيادي بوده كه از جمله مهمترين آنها مي توان آنها اين است كه اين روشها قادر به شناسايي عامل بيماري در دوران كمون آن به خصوص مراحل اوليه نيستند. اين در حالي است كه تشخيص به موقع بيماري جهت كاهش خسارات پيش رو بسيار حياتي مي باشد. نانو كيت تشخيص عامل بيماري جاروك ليمو ترش با بازدهي بالا كيت تشخيصي بر پايه علم نانو بيوتكنولوژي جهت رديابي موثر دقيق سريع و ارزان عامل بيماري مي باشد. در كيت توليد شده سعي گرديده است ضمن حل تمام مشكلات موجود در مسير شناسايي عامل بيماري به ارائه يك روش كاملا جديد و منطبق بر اصول علمي مبادرت گردد. در اين سيستم سامانه تشخيصي از نقاط كوانتومي پوشيده شده با آنتي باديهاي پلي كلونال كه در حالت همپوشاني با Rodamin متصل به آنتي ژن IMP هستند تشكيل شده است Rodamin متصل به آنتي ژن IMP نقش گيرنده و نقاط كوانتومي متصل به آنتي باديهاي پلي كلونال در نقش دهنده انرژي را دارند. هنگام اضافه كردن آنتي ژن IMP خالص (مثلا موجود در عصاره برگ گياه مشكوك به آلودگي ) به محلول قبلي عمل جايگزيني آنتي ژن IMP خالص به جاي آنتي ژن IMP متصل به Rodamin صورت گرفته و از هم پوشاني بين گيرنده و دهنده برداشته شده و نمودارهاي قشري به سطوح پايين تر جا به جا مي شوند. اين اختراع در واقع امكان تشخيص عامل بيماري در غلظتهاي پاين عصاره آلوده را فراهم آورده است.

زعفران (Crocus sativus L.) گياهي علفي، چندساله و متعلق به خانواده¬ي زنبقيان (Iridaceae) است. رويشگاه اوليه¬ي زعفران در ايران در دامنه¬ي كوه¬هاي زاگرس و به ويژه ناحيه¬ي الوند مي باشد. اين گياه به عنوان گران¬ترين ادويه در جهان شناخته مي¬شود. در طي سال هاي اخير بيماري پوسيدگي بنه، غلاف و برگ در مزارع زعفران استانهاي خراسان رضوي و جنوبي گسترش زيادي يافته است. مهمترين روش مديريت اين بيماري استفاده از بنه هاي سالم و عاري از باكتري مي باشد. با توجه به هزينه بر بودن روش هاي مرسوم، توليد كيت تشخيص سرولوژيكي اختصاصي بيماري پوسيدگي بنه زعفران مي¬تواند در شناسايي محصولات آلوده مورد استفاده قرار گيرد. براي ‌اين منظور جداسازي باكتري از نمونه هاي گياهي آلوده صورت پذيرفته و پس از تهيه كشت خالص اين باكتري، از سلول هاي كشته شده و فيكس شده باكتري B. gladioli براي ‌ايمني‌زايي خرگوش و توليد آنتي‌بادي اختصاصي باكتري استفاده مي¬شود. خالص سازي ‌ايمونوگلوبولين از سرم انجام گرفته و با آنزيم آلكالين فسفاتاز نشاندار مي¬شود. شناسايي نمونه¬هاي گياهي آلوده با استفاده از آنتي بادي تهيه شده در اين فرايند با روش الايزا و دات بلات صورت مي¬پذيرد. نتايج حاصله حاكي از كاركرد موثر و دقيق اين فرايند براي شناسايي بيماري در نمونه¬هاي گياهي مي¬باشد. The production process of the diagnostic kit of Burkholderia gladioli bacteria, the cause of saffron stem and shoot rot