گياهان به عنوان يكي از مهمترين بيوراكتورها و ميزبان جديدي براي توليد داروهاي زيستي، پليمرها، واكسن¬ها، آنزيم¬ها، پروتئين¬هاي پلاسما و آنتي¬بادي¬ها شناخته شده¬اند. توليد پروتئين¬هاي نوتركيب در گياهان داراي مزاياي زيادي است؛ اولاً سيستم‏هاي گياهي در مقايسه با ساير روش¬هاي صنعتي توليد (مانند باكتري¬ها، مخمرها يا لاين¬هاي سلولي كشت شده انساني و حيواني) اقتصادي¬تر هستند و قادر به توليد مقادير بسيار زيادي از پروتئين نوتركيب با قيمت ارزان مي باشند. ثانياً گياهان حاوي واكسن و يا پروتئين نوتركيب را مي توان در شرايط محيطي معمولي نگهداري نمود. همچنين گياهان توانايي انجام بعضي تغييرات پس از ترجمه را بر روي پروتئين¬هاي نوتركيب مانند سيستم¬هاي طبيعي بدن انسان دارند. علاوه بر اين¬ها به دليل آنكه گياهان ميزبان هيچ عامل بيماري¬زاي مشترك انساني نمي باشند، لذا خطر امكان انتقال بيماري از گياهان به انسان غيرممكن يا حداقل است. در بدن انسان تأمين اكسيژن و مواد غذايي و خارج نمودن مواد زائد، به كمك دستگاه گردش خون انجام مي‌شود. همچنين رگ‌زايي براي رشد و بهبود بافت¬ها و ترميم زخم¬ها مورد نياز مي‌باشد. فرايند رگ¬زايي در بدن به شدت كنترل مي¬شود و مكانيسم¬هاي دقيق و پيچيده¬اي در ارتباط با اين پديده وجود دارد، با اين حال رگ¬زايي بيش از حد و نابجا و يا رگ¬زايي ناقص در بسياري از بيماري¬ها مانند سرطان، مشاهده مي شود. همچنين به كمك سيستم گردش خون، سلول‌هاي سرطاني در سراسر بدن پخش شده و متاستاز صورت مي‌گيرد. گيرنده 2 فاكتور رشد اندوتليال عروقي(VEGFR-2) مهمترين و شناخته شده‌ترين عامل براي ايجاد عروق خوني جديد در بدن انسان است. در عين حال، VEGFR-2 يك آغازگر اصلي در رگ¬زايي تومورها بوده و فاكتور اصلي در رشد و متاستاز تومورهاي سرطاني به¬شمار مي آيد. در بسياري از تومورهاي سفت مانند ملانوما، پستان، سرطان كولون، كليه، مثانه، تخمدان، پروستات و لوسمي-ها افزايش بيان VEGFR-2 گزارش شده است، بدين جهت اين پروتئين مي¬تواند هدف مناسبي براي درمان سرطان باشد. در اين پژوهش ژن فيوز شده نانوبادي ضد VEGFR-2 و توكسين PE38 به كلروپلاست گياه توتون منتقل گرديد. بدين منظور توالي نانوبادي ضد VEGFR-2 بر اساس ترجيح كدوني كلروپلاست توتون تغيير داده شده و براي افزايش كارايي نانوبادي، توكسين PE38 سودوموناس با كمك اتصال دهنده به آن متصل شده و به ناقل كلروپلاستي منتقل گرديد. اين ناقل داراي منطقه تنظيمي psbA و قسمت 5’ UTR آن، ژن آنتي¬بيوتيك aadA و پيشبرنده Prrn بود. براي نوتركيبي همولوگ نيز از مناطق جانبي (trnI/trnA) طبيعي توتون استفاده گرديد. انتقال ژن به گياه با روش بيوليستيك انجام شده و باززايي گياهان تراريخت و غربالگري آن ها با كمك آنتي¬بيوتيك اختصاصي صورت گرفت. به منظور رسيدن به هموپلاسمي كامل در گياهان ترانسپلاستوميك حداقل سه بار باززايي انجام شد. بعد از باززايي، استخراج DNA ژنومي گياه تراريخت انجام شده و با استفاده از تكنيك PCR حضور ژن نوتركيب در گياه تراريخت تاييد گرديد. براي بررسي انجام نسخه‌برداري ژن فيوز شده نانوبادي ضد VEGFR-2 و توكسين PE38 آناليز RT-PCR از گياهان تراريخت توتون انجام پذيرفت. كه در نتيجه كل پروتئين از برگهاي گياه تراريخت استخراج شده و با استفاده از تكنيك هاي Dot Blot، الايزا و Western blot بيان ژن نوتركيب مورد بررسي نهايي قرار گرفت. مصرف آنتي¬بادي¬هاي با اهداف تشخيصي و درماني روز بروز افزايش مي يابد و ايجاد يك سيستم كارا به منظور توليد انبوه و ارزان آن ها ضروري است، لذا بهره برداري از بيوراكتورهاي گياهي ضرورتي اجتناب ناپذير است. با توجه به اينكه تاكنون گزارشي در مورد انتقال پايدار كلروپلاستي نانوبادي VEGFR-2 متصل به توكسين PE38 به هيچ گياهي گزارش نشده است، اين دستاورد مي تواند مسير جديدي در كشاورزي مولكولي باز كند.

سيستم زراعت ملكولي (Molecular farming) داراي مزاياي بسياري است كه مي‌توان به هزينه توليد پائين، مقياس‌پذيري بالا و عدم وجود عوامل بيماريزاي انساني در گياهان اشاره نمود. علاوه بر اين، مهندسي كلروپلاست نيز چندين مزيت دارد كه مي‌¬توان بر سطوح بالايي از بيان ژن انتقال يافته هدف به دليل تعداد نسخه زياد ژنوم و عدم خاموشي ژن، توارث مادري پلاستيدها، نبودن ژن انتقال‌يافته در دانه گرده و در نتيجه عدم فرار ژن و بيان چندين ژن با يك پيشبرنده (Promoter) در سيستم اُپروني مشابه با پروكاريوت‌ها تأكيد نمود. كلروپلاست‌هاي تراريخت گياهان، بيوراكتورهاي ايده‌آلي براي توليد پروتئين‌هاي تشخيصي و درماني مي‏باشند. امروزه، سرطان يكي از مهم‌ترين بيماري‌هاي تهديد كننده زندگي بشر است. رگزايي نقش مهمي را در رشد، تهاجم و پيشرفت سرطان ايفا مي‌نمايد و لذا مهار آن رويكردي مهم براي درمان سرطان مي‌باشد. بيان ژن VEGFR2 - يك ملكول مرتبط با فرآيند رگزايي تومور- در عروق تومور به شدت افزايش مي‌يابد. بنابراين، آنتي‌ژن VEGFR2 يك هدف منطقي براي روش‌هاي درماني سرطان است. براي رسيدن به اين هدف، نانوبادي‌ها كانديداهاي مناسبي مي‌باشند. نانوبادي‌ها (يا VHH¬ها)، قطعات تك دُمين متصل‌شونده به آنتي‌ژن هستند كه از آنتي‌بادي‌هاي زنجيره سنگين شتر به دست مي‌آيند. نانوباد¬ي‌ها به دليل داشتن خصوصياتي نظير اندازه كوچك، پايداري و حلّاليت بالا و توانايي اتصال به اپي‌توپ‌هايي غير‌قابل دسترس براي آنتي‌بادي‌هاي معمول، براي بسياري از كاربردهاي تشخيصي و درماني مناسب مي‌باشند. در اين پژوهش پس از تهيه سازه مناسب و انتقال ژن هدف به پلاستيدها، بيان نانوبادي Anti-VEGFR2 در كلروپلاست‌هاي كاهو مطالعه شد. از جمله دلايل انتخاب گياهو كاهو به عنوان يك بيوراكتور طبيعي براي توليد پروتئين نوتركيب مي‏توان به امكان دستيابي به سطوح بالايي از بيان در كلروپلاست‌هاي محصولات برگي، دوره رشد كوتاه و توانايي رشد تحت شرايط كنترل‌شده گلخانه اين گياه اشاره نمود. به منظور انتقال ژن به ژنوم كلروپلاست، از روش بيوليستيك استفاده گرديد. سپس چندين مرحله باززايي و بازكشت گياهان تراريخت ترانس‌پلاستوميك بر سطح محيط كشت حاوي آنتي‌بيوتيك انجام پذيرفت. براي اطمينان از انتقال ژن هدف به كلروپلاست كاهو از روش PCR و براي حصول كامل از هموپلاسم بودن گياهان ترانس‌پلاستوميك از روش Southern blotting استفاده شد. بعلاوه از روشRT-PCR براي بررسي بيان نانوبادي نوتركيب در سطح RNA و روشهايي نظير ELISA و Western blotting براي بررسي بيان پروتئين نوتركيب متصل‌شده به توكسين استفاده شد. نتايج بررسي‏ها نشان دادند كه RNA و پروتئين ايمنوتوكسين توانايي بيان در كلروپلاست كاهو را دارند. در تحقيق حاضر، براي اولين بار گياه كاهوي تراريخت بيان كننده پروتئين ايمنوتوكسين توليد شد. با توجه به نقش مهم آنتي‏بادي‏ها و مشتقات آن در تشخيص و درمان بيماري‏ها و هزينه‏هاي بالاي توليد آن‏ها در ساير سيستم‏ها، مي‏توان با توليد اين پروتئين در سيستم گياهي زمينه توليد انبوه و ارزان آن را فراهم نمود. اميد است كه اين دستاورد بتواند روزنه‏اي جديد در زراعت ملكولي و در جهت بهبود زندگي بشر ايجاد نمايد. چرا در صورت بهينه شدن سيستم بيان پروتئين نوتركيب در گياه كاهو، مي توان از آن براي توليد واكسن‏هاي خوراكي نيز بهره جست.

به منظور شكست خواب بذر بسياري از گونه هاي گياهي مخصوصا گياهان دارويي طراحي و ساخت محفظه ويژه جوانه زني (Germibox)مد نظر قرار گرفت. تحقيقات انجام شده نشان داد استفاده از هورمونهاي گياهي همراه با سرمادهي مرطوب تا حدودي به حل مشكل جوانه زني كمك كرده است ولي باز شرايط كاشت در ظروف پتري و ساير ظروف مشابه از نظر ايجاد ميكرو كليماي مناسب براي جوانه زني از نظر نور و رطوبت تفاوت زيادي با شرايط طبيعي دارد كه باعث مي گردد جوانه زني بطور مطلوب صورت نگيرد. با توجه به موارد فوق نياز به طراحي و ساخت فضايي كه نزديكتر به شرايط طبيعي باشد احساس گرديده و با الهام از شرايط طبيعي جوانه زني بذر اين گياه در خاك، اقدام به ساخت محفظه هاي ويژه اي شد با نام محفظه ويژه جوانه زني يا Germibox كه اجزاء و ويژگي هاي آن به اين شرح است: براي ساخت اين محفظه ها از شيشه هاي معمولي درب دار و قابل اتوكلاو، كاغذ صافي، پرليت و لوله آزمايش مناسب استفاده گرديد. براساس اندازه شيشه و لوله هاي آزمايش، كاغذصافي به ابعاد 6 در 15 سانتيمتر تهيه شد. اين كاغذها با برش در قسمت انتهايي به دور لوله آزمايش پيچيده شد و لوله هاي كاغذي با طول حدود 5 سانتيمتر تهيه شد. سپس مقداري پرليت درون شيشه ريخته شد تا لوله هاي كاغذي به كف شيشه برخورد نكند. به تعداد لازم از اين لوله ها ساخته شد و با هم درون شيشه قرار داده شد كه تعداد لوله با توجه به حجم شيشه هاي مورد استفاده و قطر لوله ها متفاوت است. فضاي اطراف لوله ها با پرليت پر گرديد. مقدار 50 ميلي ليتر آب مقطر (بستگي به حجم شيشه و ميزان پرليت استفاده شده دارد) يا هر آب مناسبي كه ممكن است بعنوان تيمار استفاده شود داخل شيشه ريخته، درب آن بسته شده و شيشه اتوكلاو گرديد. در موارد ضروري مي توان دوبار محفظه ويژه جوانه زني را اتوكلاو نمود. محفظه ها مي تواند براي بذرهاي هرگياه كه نياز به سرمادهي يا شرايط تاريك و مرطوب دارد استفاده گردد. بذرها پس از ضدعفوني و اعمال تيمارهاي مورد نظر در زير هود استريل براي گذراندن دوره مورد نظر در اين محفظه ويژه جوانه زني قرار مي گيرد. با پيچيدن پارافيلم به دور درب محفظه از آلودگي جلوگيري مي شود. محفظه ها به شرايط سرد يا هر شرايط مناسب ديگر براي اعمال شرايط دمايي مناسب منتقل مي گردد.

توليد پروتئين هاي نوتركيب از مهمترين دستاوردهاي بيوتكنولوژي و مهندسي ژنتيك در سال هاي اخير بوده است در حال حاضر نيز تقاضاي زيادي براي توليد پروتئين هاي نوتركيب انساني جهت درمان و تشخيص وجود دارد. پرو انسولين انساني نيز به عنوان يكي از اين پروتئين هاي ارزشمند يك پروتئين مدل براي تحقيقات در زمينه مصرف خوراكي ماكرومولكول ها شناخته شده مورد استفاده قرار مي گيرد. نزديك به 0/7 درصد جمعيت جهان به نوعي از ديابت مرتبط با انسولين رنج مي برند. تخمين زده مي شود كه تعداد افراد مبتلا به ديابت در آينده نزديك دو برابر خواهد شد و تقريبا 300 ميليون نفر در 25 سال آينده به اين بيماري مبتلا خواهند شد. تا به حال درمان با استفاده از انسولين تنها روش موثر براي درمان ديابت نوع اول بوده است. درمان اين بيماران نيازمند تنظيم دقيق ميزان قند خون با تزريق متناوب انسولين مي باشد. سخت بودن تزريق به بدن توسط خود شخص بيمار منجر به عدم رضايت بيماران از اين روش تزريق شده است. براي فائق آمدن بر اين مشكل روشهاي مختلفي براي راحتي مصرف انسولين ايجاد شده اند كه شامل مصرف ريوي انسولين و مصرف از طريق بيني مي باشد. اگر چه ممكن است اين روشهاي مقبول واقع شوند ولي براي جبران كاهش جذب از طريق اين روشها ميزان دز بيشتر (5 الي 20 برابر) مورد نياز است. همراه با افزايش تعداد بيماران ديابتي در دنيا معرفي روشهاي مكمل جديد براي مصرف اين هورمون و همچنين افزايش تقاضا براي هورمون انسولين (ميزان رشد 3 الي 4 درصد در سال) قابل پيش بيني است. روبرو شدن با اين ميزان تقاضا لزوم توسعه روشهاي ارزان مقرون به صرفه و با ظرفيت توليد بالا را در آينده نشان مي دهد. مطالعات اخير نشان داده است كه كشاورزي مولكولي Molecular Farming در گياهان از نظر عملي اقتصادي و ايمني نسبت به بسياري از سيستم هاي معمول توليد پروتئين هاي نوتركيب سودمندتر مي باشد. با استفاده از گياهان مي توان هزينه توليد پروتئين هاي نوتركيب را به ميزان قابل توجهي كاهش داد. بنابراين گياهان تراريخته گزينه هاي مناسبي براي توليد تركيبات دارويي و پروتئين هاي پيچيده انساني مي باشند. در اين پژوهش ژن پروانسولين انساني در ناقل بياني گياهي pCAMBIA1304 تحت كنترل پيشبرنده CaMV35S و خاتمه دهنده NOS توسط آقاي محب الديني و همكاران به راهنمايي آقاي دكتر جلالي همسانه سازي شده بود. سپس سازه مورد نظر با روش استاندارد انجماد و ذوب به باكتري اگروباكتريوم منتقل شده و براي تراريختي گياه توت رفنگي و توليد ريشه هاي نابجا از طريق اگروباكتريوم رايزو جنسيس و به روش تلقيح دمبرگ هاي اين گياه مورد استفاده قرار گرفت. و علت انتخاب گياه توت فرنگي به عنوان بيوراكتور اين است كه علاوه بر وجود ويتامينهاي مختلف و مواد معدني ارزشمند و وجود قند لولوز در اين گياه كه طبق گفته ي پزشكان اين نوع قند مشكلي را براي بيماران ديابتي ايجاد نمي كند اگر هر ژني را به يك گياه انتقال دهيم براساس نسبت مندلي حداقل 1/4 گياهان نسل بعد غير تراريخت خواهند بود. اما گياه توت فرنگي به علت داشتن ساقه هاي رونده Runner كه يك كلون از گياه مادري مي باشد مي تواند به عنوان يك گياه مدل بسيار مناسب براي بررسي بيان ژن انتقال داده شده مطرح باشد. بعد از توليد ريشه هاي نابجا حاصل از تلقيح اگروباكتريوم رايزوجنسيس در گياه توت فرنگي استخراج DNA ژنومي از ريشه هاي تراريخت انجام شده و با استفاده از تكنيك PCR حضور ژن پروانسولين انساني د ريشه هاي تراريخت تاييد گرديد. در نهايت كل پروتئين از ريشه هاي تراريخت حاصل از تلقيح اگروباكتريوم رايزوجنسيس در گياه توت فرنگي استخراج شده و با استفاده از تكنيك Dot blot بيان ژن پروانسولين انساني در ريشه هاي نابجاي توليد شده مورد بررسي قرار گرفت. همچنين به منظور امكان سنجي خوراكي نمودن انسولين و توليد آن در ميوه ي گياه توت فرنگي از ريشه هاي تراريخت مورد باززايي قرار گرفت. بعد از باززايي استخراج DNA ژنومي گياه تراريخت انجام شده و با استفاده از تكنيك PCR حضور ژن پروانسولين انساني در گياه تراريخت تاييد گرديد. كه در نتيجه كل پروتيين استخراج شده از برگهاي جوان گياه توت فرنگي تراريخت و با استفاده از تكنيك Dot blot بيان ژن پروانسولين انساني در توت فرنگي مورد بررسي نهايي قرار گرفت. تحقيق حاضر اولين گزارش از بيان انتقال ژن پروانسولين در ريشه هاي نابجا حاصل از تلقيح اگروباكتريوم رايزو جنسيس به گياه توت فرنگي مي باشد. با توجه به نقش مهم درماني اين دارو و هزينه بالاي توليد آن از ساير منابع تلاش براي توليد اين دارو در ريشه هاي نابجا در سطح وسيع با هدف استخراج و توليد آن در ميوه ي گياه براي مصرف خوراكي زمينه را براي توليد ارزان تر و فراوان آن فراهم مي سازد. همچنين اين دستاورد مي تواند مسير جديدي در كشاورزي مولكولي باز كند زيرا با استفاده از اين روش به غير از توليد پروانسولين انساني مي توان پروتئين هاي نوتركيب دارويي و صنعتي مهمي مانند پلاسمينوژن بافتي انساني tPA اينترفرون و ... را با توليد در ريشه هاي نابجا به صورت مستقيم از محيط استخراج كرد. علاوه بر اين اگر گياهي به صورت طبيعي خاصيت دارويي مانند خواص ضد سرطان ضد ديابت پاركينسون آلزايمر و ... به علت وجود مقدار زيادي از اين متابوليتهاي ثانويه در ريشه مي توان به راحتي به يك منبع ارزشمند از اين خواص دارويي دست پيدا كرد.