ويروس نقص ايمني انساني نوع 1 (HIV) يكي از مهمترين عوامل عفوني منتقل شده از طريق خون محسوب مي شود. انتقال بيماري از طريق انتقال خون در دوره پنجره، در مراكز انتقال خون يك معضل جهاني محسوب مي شود. از اين رو تشخيص صحيح، دقيق و حساس اين ويروس ها در افراد آلوده و خون هاي اهدايي از اهميت بسياري برخوردار است. به علت وجود محدوديت هايي، روش هاي سرولوژيك در تشخيص اين عفونت كاارامد نيستند. روش هاي مولكولي متعددي توسعه يافته اند كه قادرند با حساسيت و ويژگي متفاوتي HIV-1 را در نمونه هاي باليني تشخيص دهند اما بدليل هزينه هاي بالا در كشورهاي در حال توسعه وبا منابع محدود قابل استفاده نيستند. دراين اختراع طراحي و راه اندازي روش TaqMan Real-Time PCR براي رديابي كيفي و كمي ويروس نقص ايمني اكتسابي انسان(HIV-1) مطرح مي شود.

miRNA ها تواليهاي كوتاه 18-25 نوكلئوتيدي و غيركد كننده هستند كه بيان ژن را در سطح پس از ترجمه تنظيم مي كنند. در اكثر موارد با اتصال به انتهاي غيرترجمه شونده(3UTR) mRNA هدف، ترجمه آن را مهار كرده يا mRNA را تخريب مي كنند.اگرچه miRNA ها فراوان هستند اما بيان آنها در بين گونه هاي مختلف متفاوت است. miRNA ها در عملكردهاي طبيعي سلول هاي يوكاريوتي نقش دارند و بنابراين عدم تنظيم بيان آنها با بيماريهاي مختلف در ارتباط مي باشد. از آنجائيكه تعدادبيشتري از miRNA ها درحال شناسايي هستند، بررسي الگوي بيان آنها ابزار مهمي در شناسايي بيان متفاوت آنها در پروسه هاي طبيعي و بيماريزايي است. چندين متود براي رديابي و بررسي بيان كمي miRNA ها ارائه شده است كه از آن ميان مي توان نوردرن بلات، فلوسيتومتري بر اساس بيد، ميكرواراي و PCR real-time كمي را نام برد. از ميان روشهاي نامبرده شده ميكرواراي و real-time PCR جالب تر هستند زيرا قابل گرفتن بازده زياد ازآنها(High throughput)) و تكرارپذيري وجود دارد. از آنجائيكه miRNA ها بسيار كوچك هستند، رديابي آنها با جفت پرايمرها و پروبهاي معمول براي real-time PCR امكانپذير نمي باشد. بنابراين يافتن راههاي جايگزين كه دقت و حساسيت كافي داشته باشند از اهميت خاصي برخوردار است. بعضي شركتها مانند Applied Biosystems, Invitrogen and Stratagene كيتهاي تجاري براي اين منظور ايجاد نموده اند . كيتهاي شركت Invitrogen و Stratagene تركيبي از واكنش اضافه نمودن پلي A هستند كه به اين صورت در واكنش مرحله اول يعني تهيه cDNA رشته اي حاصل مي شود كه دنباله پلي T است و در مرحله بعد واكنش PCR با روش SYBRGreen و با پرايمرهاي اختصاصي miRNA صورت مي گيرد. شركت Applied Biosystems براي رديابي آنها از ساختاري بنام ساقه- لوپ (stem-loop) استفاده ميكند. اين ساختار 3’ miRNA متصل مي گردد و واكنش cDNA سازي با كمك آن انجام مي شود. براي واكنش real-time PCRنيز از پرايمر اختصاصي miRNA و ساختار لوپ-ساقه استفاده مي شود. كيت تجاري Applied Biosystems حساس و كارآمدتر از دو كيت تجاري ديگر بوده اما ار نظر هزينه گران مي باشد و تواليهاي مربوط به پرايمرها و پروب و نحوه طراحي آنها در كيت ذكر نمي شود. با ايده اوليه از اين ساختار برآن شديم ساختاري لوپ- ساقه طراحي كنيم كه پايداري ترموديناميك داشته و در دماي مورد نظر براي واكنش رونوشت برداري معكوس شكل فضايي مناسبي بگيرد كه قابليت اتصال به miRNA را در شرايط cDNA سازي داشته باشد. دماي مورد نظر براي Tm اين ساختار با بكارگيري برنامه هاي طراحي پرايمر بهينه سازي شده و با انجام آزمايشات تجربي تائيد شد، بطوريكه دماي جداشدن نيمي از دو رشته ها از به حدود 80 درجه سانتي گراد رسيد. به انتهاي ساختار ساقه- لوپ، 6-8 نوكلئوتيد مكمل انتهاي ’3 هر miRNA اضافه شد تا امكان cDNA سازي اختصاصي تر را فراهم نمايد. بنابراين براي هر miRNA يك ساختار حدود 70 نوكلئوتيدي كه شامل بخش ثابت ساقه- لوپ و انتهاي ’3 متغير (مربوط به شناسايي miRNA) بود طراحي شد. براي طراحيها از برنامه هاي AlleleID6، GeneRunner، Oligo6 و mfold(براي بررسي ساختارهاي ثانويه) استفاده شد. با توجه به اينكه هزينه پروب اختصاصي براي هرmiRNA زياد خواهد بود براي استاندارد كردن و كم كردن هزينه ها يك پروب همگاني براي همه miRNAهاي مورد بررسي طراحي شد. پرايمر سنس براي هر miRNA مكمل توالي نوكلئوتيدي miRNA (با كنار گذاشتن نوكلئوتيدهايي كه براي اضافه نمودن به انتهاي ساختار ساقه- لوپ بكار رفته بود) طراحي شد. بر روي ساقه ساختار ساقه- لوپ نيز پرايمر آنتي سنس به صورت مشترك و همگاني طراحي شد تا امكان رديابي انواع miRNA كوتاه را فراهم نمايد.