ويروس آنفلوانزا متعلق به خانواده ارتوميكسوويريده بوده و شامل سه تيپ A، B وC هست. ويروس هاي آنفلوانزا پرندگان يكي از دلايل اصلي ايجاد تلفات بالا و خسارات اقتصادي در صنعت طيور هستند. علاوه بر آن، آنفلوانزاي پرندگان و سويه هاي جديد آن توانايي ايجاد پاندمي هاي مشابه آنچه در اسپانيا در 1918 و هنگ كنگ در 1968 روي داد، را دارند. تحقيقات در مورد شناسايي ساختار، روش هاي كارآمد و سريع جهت تشخيص، كنترل و پيشگيري در مورد ويروس آنفلوانزا از سال 1918 به بعد شدت يافت و مطالعات زيادي در جهت توليد واكسن هاي كشته و نوتركيب ويروس، بر روي گليكو پروتئين هاي سطحي HA و NA انجام شد، كه تاكنون نيز ادامه دارد. هدف از انجام پژوهش حاضر طراحي پرايمرهاي اختصاصي ناحيه Cleavage site مولكول هماگلوتينين ويروس آنفلوانزاي پرندگان A/chicken/Iran/772/1998(H9N2) ، كلونينگ ناحيه مورد نظر در وكتورهاي بياني و توليد آنتي ژن نوتركيب هماگلوتينين از اهداف به دست آمده در اين پژوهش مي باشد. براي اين منظور ابتدا ويروس آنفلوانزاي پرندگان تحت تيپ H9N2 با مشخصه A/Chicken/Iran/ 772/1998(H9N2) در مايع آلانتوئيك تخم مرغ جنين دار تكثير و RNA ويروس جداسازي شد. سپس بر اساس اطلاعات موجود در بانك داده ها (NCBI) با استفاده از توالي ژن هماگلوتنين پرايمر هاي اختصاصي طراحي شد. ناحيه ژني مورد نظر تكثير و در پلاسميد PTZ57R كلون و در باكتري E. coli GM2163 ترانسفورم و توالي يابي گرديد. سپس از كلون هاي تائيد شده پلاسميد جدا سازي و با آنزيم هاي محدود كننده برش داده شد. قطعات بريده شده با آنزيم هاي محدود كننده خالص سازي گرديد و به وكتورهاي بياني گروه PET و باكتري E. coli BL21(DE3) انتقال يافت. وجود قطعه ژني Insert در پلاسميد به روش PCR با پرايمرهاي T7 و توالي يابي تأييد گرديد. القا بيان ژن ناحيه Cleavage site از مولكول هماگلوتنين در باكتري هاي E .coli BL21(DE3) با استفاده از IPTG انجام شد و وجود پروتئين مورد نظر و سايز آن با استفاده از الكتروفورز SDS –PAGE و وسترن بلاتينگ تأييد گرديد. از مزاياي توليد اين آنتي ژن نوتركيب مي توان به هموار شدن مسير براي توليد صنعتي كيت هاي تشخيصي ويروس آنفلوانزاي پرندگان با حساسيت و اختصاصيت بالا در كشور و بومي سازي اين صنعت اشاره كرد. از سوي ديگر مي توان با بهره گيري از اين آنتي ژن اقدام به طراحي واكسن هاي نوتركيب آنفلوانزا در آينده نمود. ضمنا مزيت اختراع فوق نسبت به ساير روش¬هاي پيشين به شرح زير مي باشد: 1- توليد آنتي ژن اختصاصي نوتركيب هماگلوتنين ويروس آنفلوانزاي پرندگان با استفاده از سوش بومي كشور 2- بومي سازي توليد آنتي ژن نوتركيب هماگلوتينين ويروس آنفلوانزاي پرندگان در كشور و توليد انبوه آن 3- هموار شدن ساخت انواع كيت هاي تشخيص آنفلونزاي پرندگان با استفاده از آنتي ژن نوتركيب ساخته شده 4- با توليد آنتي ژن مذكور بستر لازم براي شروع تحقيقات جديد در زمينه توليد واكسن نوتركيب و كيت هاي تشخيص دقيق و حساس براي بيماري آنفلوانزاي پرندگان مهيا مي گردد. 5- با بهره گيري از اين آنتي ژن و ساخت كيت تشخيصي با دقت بالا، ميتوان ضمن صرفه جويي قابل توجه در زمان، هزينه تشخيص بيماري آنفلوانزاي پرندگان را بسيار كاهش داد.

كيموزين (رنين ، EC 3.4.23.4) يك آنزيم آسپارتيك پروتئاز مي باشد كه در شيردان نوزاد نشخواركنندگان ترشح مي گردد. اين آنزيم مولكول كاپا كازئين را به صورت اختصاصي مي شكند و سبب لخته كردن شير مي گردد بنابراين از اين آنزيم در صنعت پنيرسازي استفاده مي شود. به دليل اهميت اين آنزيم براي صنايع شير و كمبود آن، ما تصميم به توليد پروكيموزين بزي نوتركيب گرفتيم. از چند راس بزغاله ي بومي ايران، بافت شيردان بدست آمد و RNA نام آن استخراج گرديد. از روي RNA تام و به كمك آنزيم ترانس كريپتاز معكوس، cDNA تك رشته اي پري پروكيموزين بزي ساخته شد و سپس با كمك واكنش PCR از روي آن cDNA دو رشته اي ساخته شد. cDNA به دست آمده با پلاسميد pTZ57RT اتصال داده شد و توالي نوكلئوتيدي آن هم مشخص شد. سپس قطعات پروكيموزين با آنزيم هاي NdeI-EcoRI,EcoRI-EcoRI برش داده شدند و در جايگاه مناسب در پلاسميد pET-28a به نحوي قرار داده شدند كه در انتهاي آميني اين قطعات His-tag قرار بگيرد. پلاسميدهاي نوتركيب به درون باكتري E.coli BL21(DE3) ترانسفورم گرديدند و القاي بيان ژن با غلظت هاي 0/4 و يك ميلي مولار IPTG و لاكتوز در دماهاي 28، 32، 37 و 42 درجه سانتي گراد صورت گرفت. پروكيموزين نوتركيب به دو فرم محلول در سيتوپلاسم و غير محلول و به شكل Inclusion Body توليد شد كه با استفاده از ستون جاذب His-tag خالص سازي شد. نتايج نشان داده كه پروكيموزين بيشتر به فرم غير محلول و حداكثر تا 15% پروتئين تام سلولي توليد شد. پس از مراحل فعال سازي پروكيموزين نامحلول ميزان فعاليت آن اندازه گيري شد كه نتايج نشانگر فعاليت بسيار بالاي آن مي باشد. از دلايل اين فعاليت كم مي توان به وجود His-tag در انتهاي آميني پروكيموزين و ايجاد تداخل در روند فعال شدن آن اشاره كرد.