"توليد پروتئين نوتركيب اينترفرون بتاي جهش يافته-بخش متغير تك زنجيره (scFv) آنتي بادي ضد كلاژن تيپ II انساني در رده سلولي HEK293 با دورنماي درمان بيماري آرتريت روماتوئيد" پروتئين نوتركيب توليد شده در اختراع حاضر داراي دو بخش ناحيه ي متغير scFv ضد كلاژن تيپ II انساني و اينترفرون بتا مي باشد. در اين اختراع هدف از اتصال scFv ضد كلاژن تيپII انساني به اينترفرون بتاي انساني جهش يافته، انتقال اختصاصي و هدفمند اينترفرون بتا به مفصل (حاوي كلاژن تيپII) با دورنماي درماني براي بيماري آرتريت روماتوئيد بوده است. داروهاي كنوني براي درمان اين بيماري همراه با اثرات جانبي زيادي هستند درحالي كه پروتئين نوتركيب هدفمند حاضر به علت تمركز در بافت هدف با كاهش اثرات جانبي همراه خواهد بود. در اين پروژه و با استفاده از تكنولوژي DNA نوتركيب، پس از طراحي، ساخت و ترانسفكشن وكتور داراي سازه ي ژني نوتركيب IFNβ-scFv ضد كلاژن تيپII انساني به رده ي سلولي HEK293، بيان سازه ي ژني نوتركيب با روش Real-time PCR و پروتئين نوتركيب با روش هاي SDS-PAGE، وسترن بلات و In house ELISAبررسي گرديد. در انتها عملكرد اينترفرون بتا در پروتئين نوتركيب، با تأثير اين پروتئين نوتركيب بر سلول هاي تك هسته اي خون محيطي (PBMC) و سپس مشاهده ي افزايش بيان ژن MxA با تكنيك Real-time PCR تأئيد شد.

اينترفرون بتا واجد تأثيرات گسترده‌اي از جمله تأثيرات ضد ويروسي، ضد التهابي و ضد توموري بوده لذا به عنوان بك داروي مهم و پركاربرد در درمان بيماري‌هاي مختلف مانند عفونت‌هاي ويروسي و MS كاربرد دارد. از اين‌رو تلاش‌هاي گسترده‌اي در جهت افزايش پايداري mRNA، افزايش ميزان ترجمه و بهينه‌سازي شرايط توليد اين داروي مهم صورت گرفته است. در ضمن اين اختراع تلاش شده است با استفاده از روش‌هاي مهندسي ژنتيك كانستركت‌ جديدي از ژن اينترفرون بتا با هدف بهبود كيفيت و ميزان توليد دارو توليد گردد. كانستركت مورد نظر حاوي جهش در توالي AREموجود در ناحيه‌ي كد كننده‌ (CRID) بوده كه براي اولين بار در سطح جهان انجام پذيرفته است به طوري كه تغيير الگوي توالي ناپايدار كننده در اين ناحيه سبب القاي پايداري آن مي‌گردد. تغيير در توالي ARE با استفاده از روش Soeing PCR انجام شد. به منظور مقايسه‌ي بيان و توليد اينترفرون بتا كانستركت حاوي ژن وحشي (فاقد جهش) اينترفرون بتا نيز توليد گرديد. ژن اينترفرون نوتركيب و وحشي در وكتور pSVM- dhfr كلون گرديد. در ادامه ترانسفورماسيون پلازميدهاي pSVM- dhfr حاوي ژن اينترفرون بتا در لاين سلولي CHO-dhfr- با استفاده از كيتLipofectamine صورت پذيرفت. تغييرات ايجاد شده در بيان ژن اينترفرون بتا با استفاده از روش Real Time PCR مورد بررسي قرار گرفت. در نهايت نتايج به دست آمده با استفاده از روش آماري CtΔΔ- 2 مورد تجزيه‌ي آماري قرار گرفت. بررسي‌هاي نهايي انجام شده نشان داد كه جهش‌ موجود در توالي CRID تأثير چشمگيري را بر روي بيان اينترفرون بتا داشته‌ به‌طوري كه سبب افزايش بيان چهار برابري ژن اينترفرون بتا گرديده است. لازم به ذكر است اعمال اين تغييرات و افزايش توليد پروتيئن اينترفرون بتا، با توجه به نقش دارويي و استفاد‌ه‌ي روزافزون از اين دارو، تأثير بسزايي در كاهش هزينه‌هاي توليد توسط شركت‌هاي توليد كننده‌ي دارو داشته و كاهش هزينه‌هاي توليد، كاهش قيمت نهايي دارو را به همراه دارد. بنابراين نتايج اين تحقيق در بعد اقتصادي نيز حائز اهميت بوده و علاوه بر صرفه‌جويي اقتصادي براي شركت توليد كننده، تأثير مهمي در كاهش هزينه‌هاي دارو و افزايش رضايت‌مندي بيماران به همراه دارد.

VEGF-A مهم ترين و كليدي ترين فاكتور رگ‌زايي بوده و تنها فاكتوري است كه در تمام سيكل زندگي يك تومور، حضور و عملكرد آن لازم و ضروري است. بيان اين فاكتور رشد در بافت توموري به شدت افزايش يافته و رگ‌زايي را القا مي‌نمايد. مطالعات گسترده‌اي كه بر روي مكانيسم‌هاي كنترل كننده پيچيده بيان VEGF-A انجام گرفته، نويد بخش درمان‌هاي موثرتر براي انواع سرطا‌ن‌ها مي‌باشد. هدف اصلي تمامي اين روش‌ها، كاهش بيان VEGF-A در توده توموري و در نتيجه كاهش رگ‌زايي بوده كه از اين طريق رشد و متاستاز تومور مهار مي شود. يكي از جديدترين روش‌هاي درماني ضد رگ‌زايي، استفاده از انواع واريانت‌هاي ضد رگ‌زايي(VEGFxxxb) است. در بين تمام ايزوفرم‌هاي VEGF-A، فاكتور جديد VEGF-111bبا ويژگي ضد رگ‌زايي و پايداري بسيار بالا از اهميت ويژه‌اي در تحقيقات سرطان برخوردار بوده و به عنوان يك فاكتور درماني پيشنهاد مي‌شود. افزايش رگ‌زايي يكي از مشكلات مهم در پزشكي و در بسياري از اختلالات شامل انواع سرطان‌ها و بيماري‌هاي شبكيه مي‌باشد. ويژگي ضد رگ‌زايي در واريانت 111VEGF و مقاومت آن نسبت به فرآيند پروتئوليز، آن را به كانديد جالب و جذاب براي كاربردهاي درماني ضد رگ‌زايي در سرطان تبديل نموده است. در پروژه حاضر، فاكتور VEGF-111b با استفاده از تكنيك‌هاي مهندسي ژنتيك براي اولين بار در ايران و جهان به صورت نوتركيب دو لاين سلولي CHO dhfr- و HEK 293 توليد گرديد. با توجه به گسترش آمار ابتلا به سرطان در سراسر جهان و ايران، توليد داروها و فاكتورهاي رشد نوتركيب در راستاي درمان و تحقيقات مورد نياز براي اين بيماري از اهميت فوق العاده‌اي برخوردار است. عملي نمودن پروژه حاضر گامي نو در راستاي پاسخ به نياز كشور در بومي‌سازي درمان‌هاي ضد رگ‌زايي سرطان مي‌باشد.