در اين اختراع پايداري اريتروپويتين به عنوان داروي پروتئيني بيان شده در سلول حيواني در حضور 16 ماده شيميايي پايداري كننده اريتروپويتين، به عنوان چپرون شيميايي مختلف بررسي شد. در اين رابطه تجمع پروتئين ايجاد شده با حرارت با روش كدورت سنجي، DLS و روشهاي فيزيكي و شيميايي ديگر بررسي شد. روش كدورت سنجي در پليت 96 خانه به عنوان روشي ارزان و ساده براي غربالگري مواد شيميايي در پايداري پروتئين به شكل وسيع با روش تسهيل شده حرارتي، بكار رفت. اثر 16 ماده شيميايي سيستئين، دكستران، مانيتول، بتائين، ترهالوز، تورين،لينولئيك اسيد، بتاسيكلودكسترين، سولفات مس و اسپرميدين، مالتوز، بتاآلانين، مالتودكسترين، ميواينوزيتول، سوكروز و لينولئيك اسيد كونژوگه شده در تجمع اريتروپويتين ايجاد شده با حرارت، بررسي شد. سپس مواد فوق به عنوان پايدار كننده اختصاصي در آزمايشات بعدي از جمله طيف سنجي فلورسنس بكار رفتند. در مرحله بعد اثر 16 چپرون شيميايي بر رشد سلول CHO نوتركيب و توليد اختصاصي اريتروپويتين (qEPO) و تجمع داخل و خارج سلولي آن بررسي شد. همچنين در اين مطالعه اثر چپرونهاي مولكولي و افزايش سايز شبكه اندوپلاسمي ايجاد شده توسط چپرونهاي شيميايي بر بيان اريتروپويتين در سلول CHO بررسي شد. در اين مرحله هر 16 ماده قبلي مورد استفاده قرار گرفتند و اثر آنها بر ترشح اريتروپويتين در سلول CHO بررسي شد. همچنين در مجاورت سلول با مواد شيميايي پاسخ پروتئين فولد نشده (UPR) را با بررسي بيان اريتروپويتين و چپرونهاي اندوژن مقيم شبكه اندوپلاسمي و گسترش شبكه اندوپلاسمي مطالعه شد. گسترش شبكه اندوپلاسمي با استفاده از نشاندار كردن اختصاصي آن با استفاده از گلايبن كلامايد كونژوگه شده با FITC و بيان چپرونهاي مولكولي با استفاده از real-time polymerase chain reaction بررسي شد. از طرف ديگر گسترش شبكه اندوپلاسمي در مجاورت بتاآلانين، بتاسيكلودكسترين و تورين باعث افزايش توليد و ترشح اريتروپويتين شد. افزايش بيان ژن اريتروپويتين بالايي در مجاورت لينولئيك اسيد كونژوگه شده، اسپرميدين، ترهالوز و مالتوز به ترتيب 19، 20، 16 و 19 برابر مشاهده شد و بتائين بدون افزايش سايز ER با افزايش جزئي بيان EPO توليد اريتروپويتين را افزايش داد.

اختراع حاضر مربوط به توليد كيت الايزا تشخيص سرولوژي بيماران مبتلا به بروسلوز (تب مالت) مي باشد. در اين كيت براي اولين بار يك تركيب آنتي ژني حاوي whole cell Brucella abortus S99 lysates به عنوان ماده ليز شده كل پيكره باكتري بروسلا و به منظور تشخيص آنتي بادي كلاس IgM ضد باكتري بروسلا در سرم انسان استفاده گرديده است. تشخيص سريع و دقيق بيماري بروسلوز در فاز هاي اوليه توسط اختراع فوق سبب كاهش زمان و هزينه هاي درماني مي شود. معرف هاي كيت شامل آنتي ژن whole cell Brucella abortus S99 lysates كوت شده در پليت 96 خانه اي الايزا، محلول كونژوگه (آنتي بادي بزي ثانويه كونژوگه با HRP بر عليه IgM انسان)، محلول رقيق كننده و شوينده، محلول سوبسترا و محلول نگه دارنده واكنش مي باشد. غلظت مطلوب شده آنتي ژن براي كوت كردن در پليت معادل 7 ug/mLمحاسبه گرديده است. آنتي ژن به كار گرفته شده به واسطه واكنش متقاطع بين سويه ها قابليت تشخيص تمام سويه هاي صاف بروسلا را دارد. همچنين به واسطه استاندارد سازي هاي صورت پذيرفته در مواد و محلول هاي كيت فوق، اختراع حاضر ميزان حساسيت و اختصاصيت نتايج را نسبت به ساير كيت هاي مشابه افزايش داده است.

فاكتور رشد سلولهاي اندوتليال عروق نقش مهمي در رشد و تهاجم سلولهاي توموري ايفا مي كند.آنتي بادي هاي تك دوميني با منشا شتري (با نام تجاري نانوبادي) داراي اختصاصيت و افينيتي بالايي به تارگت خود مي باشند. اندازه كوچك نانوبادي ها دسترسي آنها را به مناطقي از تومور كه معمولا در دسترس ساير آنتي بادي ها قرار نميگيرد، امكان پذير ساخته است. يكي از مشكلات نانوبادي ها براي اهداف درماني، نيمه عمر پايين آنها مي باشد. راهكارهاي مختلفي براي افزايش نيمه عمر نانوبادي ها ارايه شده است كه يكي از آنها ساخت ديابادي مي باشد. ديابادي توليد شده در اين اختراع ماحصل اتصال دو نانوبادي مشابه با لينكر ناحيه لولاي آنتي بادي مي باشد. نتايج نشان داد كه ديابادي اثر مهاري بالاتري نسبت به نانوبادي بر روي تكثير، تشكيل تيوب و مهاجرت سلولهاي اندوتليال انسان دارد. علاوه بر اين نيمه عمر ديابادي در مدل موشي بالاتر از نانوبادي مي باشد. روش ارايه شده ابزار اميدواركننده اي در درمان بيماريهاي وابسته به فاكتور رشد مي باشد.

توليد انگل تراريخته ژنتيكي ليشمانيا اينفانتوم بيان كننده ژن پروتئين فلورسنت سبز

انگل ليشمانيا يوكاريوتي تك سلولي مي باشد كه عامل بيماري ليشمانيوز است. ليشمانيوز مجموعه اي از بيماريهاي انگلي وابسته به ناقل با يك طيف وسيعي از علائم باليني است كه طي آن فاگوسيت هاي تك هسته اي مورد هدف قرار مي گيرند و در نتيجه بقاي انگل درون سلولهاي ماكروفاژ ، كارائي اين سلولها را از بين مي برد. در بررسي هاي تحقيقاتي شيوه هاي مختلفي براي اندازه گيري عفونت ليشمانيا در بافت حيوانات يا در ماكروفاژهاي آلوده بصورت in vitro استفاده مي گردد (نظير مشاهده فرم آماستيگوت انگل با رنگ آميزي گيمسا) كه روشهاي دشوار و وقتگير هستند. اما امروزه استفاده از انگلهاي تراريخت شده بيان كننده ژن هاي گزارشگر براي مشاهده و رديابي سريع و آسان انگلها در بافت يا سلول آلوده در شرايط in vitro و in vivo رايج شده است. ژنهاي گزارشگر ژنهايي هستند كه فنوتيپ قابل سنجش ايجاد مي كنند و به راحتي در بين پروتئين هاي اندوژن قابل تشخيص مي باشند. ژن پروتئين فلورسنت سبز GFP يك پروتئين اتوفلورسنت است و نيازي به سوبسترا ندارد. از ديگر مزيتهاي GFP بر ديگر ژنهاي گزارشگر، سميت پائين، بيان پايدار و آسان و سريع و ارزانتر بودن آن است. پروتئين EGFP شكل جهش يافته GFP تيپ وحشي است كه فلورسنت آن در طول موج هاي بالاتر قابل رؤيت مي باشد و به سلول زنده آسيب وارد نمي كند. در اين طرح، براي نخستين بار در ايران، پلاسميد بياتي خطي شده PLEXSY حاوي EGFP را از طريق نوتركيبي مشابه در لوكوس rRNA S 18كروموزومي انگل ليشمانيا ماژور الحاق (ترانسفكشن پايداري نموديم بطوريكه بيان اين ژن تحت كنترل پروموتر RNA پليمراز قرار گيرد. تائيد ژن فلورسنت در اين انگل توسط ميكروسكوپ فلورسنت و تكنيك وسترن بلات با استفاده از آنتي بادي ضد GFP مورد تأييد قرار گرفت

داربست هاي ليفي مورد استفاده در مهندسي بافت در حال حاضر با استفاده ار تكنيك هاي ساده الكتروريسي، جمع كردن الياف بر روي ميله گردان، حاصل ميگردند. براي ساخت كانال از اين داربست ها براي مهندسي بافت سيستم هايي چون سيستم اعصاب محيطي، وجود جهت¬مندي بالاي الياف نياز است و در حال حاضر داربست هايي كه ميتوان تهيه كرد به صورت صفحات دوبعدي هستند. در اين روش نوين جمع كننده اي طراحي شده كه نه تنها الياف به دست آمده با آن داراي جهت¬مندي موازي بسيار بالا مي¬باشند، بلكه داربست به صورت يك لوله توخالي سه بعدي تشكيل ميشود. 4) شرح وضعيت دانش پيشين : الكتروريسي فرآيند استفاده از نيروهاي الكترواستاتيك براي توليد فيبر¬هاي مصنوعي است كه از حدود 100 سال پيش شناخته شده است. اين روش به علت تطبيق پذيري و نيز قابليت استفاده در زمينه هاي گوناگون بسيار مورد توجه قرار گرفته است. علاوه بر اين ، توانايي توليد فيبر¬هاي با ثبات در محدوده زيرميكرون ، از ديگر مزيت هاي اين روش است ، كه دستيابي به اين امر با استفاده از تكنيك هاي مكانيكي معمول بسيار دشوار مي باشد. در اين فرآيند از يك منبع ولتاژ بالا استفاده مي¬كنند تا باري با قطبيت مشخص را به يك محلول يا مذاب پليمر(هم پليمر هاي طبيعي و هم مصنوعي) وارد كند، كه سپس به سمت يك جمع كننده با قطبيت مخالف شتاب مي¬گيرد. با قوي تر شدن نيروي جاذبه الكتروستاتيك بين مايع و جمع¬كننده كه داراي بار مخالف اند، و نيز نيروي دافعه الكتروستاتيك بين بار هاي مشابه در مايع، لبه پيش برنده محلول از شكل هلال دايره اي به يك مخروط تغيير شكل مي دهد (مخروط تيلور). در نهايت زمانيكه قدرت ميدان الكتريكي از كشش سطحي مايع بيشتر شود، يك جت فيبري از مخروط تيلور خارج مي شود. با عبور اين جت فيبري از فضا، حلال تبخير شده و در نتيجه فيبر هاي پليمري به صورت جامد روي جمع كننده جمع مي شوند.اين تكنيك روشي نسبتاً ساده و تطبيق پذير براي توليد مواد فيبري به صورت نبافته است.

سلول‏هاي بدن در اثر ساختار آناتومي وعملكرد بافت‏هاي گوناگون همواره در معرض نيرو‏هاي مكانيكي قراردارند. اين نيروها در آرايش سلول‏ها و فنوتيپ آن‏ها تاثيرگذار هستند. سلول‏ها در اثر اين نيرو‏هاي مكانيكي تغيير مورفولوژي مي‏دهند و اين تغيير ريخت، در رشد، تمايز، جابه جايي و مرگ برنامه ريزي شده سلول تاثير مي‏گذارد. همچنين تنش‏هاي مكانيكي مسير‏هاي سيگنالي درون سلولي را فعال مي‏كنند و باعث بيان برخي از ژن‏ها مي‏شوند. شواهدي وجود دارد مبني بر اينكه نيروهاي مكانيكي در تكوين و كنترل سرنوشت سلول‏هاي بنيادي نقش مهمي دارد. از اين عوامل مي‏توان در مهندسي بافت به منظور شبيه سازي فرآيند تمايز سلول‏هاي بنيادي در محيط InVitro بهره گرفت. تلاش براي درك پاسخ سلولي به محرك‏هاي مكانيكي بر اساس مطالعات آزمايشگاهي، تحت شرايط كنترل شده استوار است. در حوزه سلول‏هاي بنيادي اغلب مطالعات بر سلول‏هاي مزانشيمي متمركز شده‏است، زيرا اين سلول‏ها قادرند به بافت‏هايي تمايز ‏يابند كه معمولا تحت بارگذاري مكانيكي هستند. در مطالعات تجربي غالبا به بررسي تاثير تنش‏هاي كششي، فشاري، برشي و تاثير آن برتمايز سلول‏هاي مزانشيمي به رده‏هاي مختلف سلولي از جمله استخوان، غضروف و تاندون پرداخته شده است. اما اخيرا تاثير رژيم‏هاي ارتعاشي بر فيزيولوژي نوسازي استخوان حيوانات با استفاده از دستگاه‏هاي اعمال ارتعاش بر كل بدن حيوان بررسي گرديده است. در كنار مطالعات حيواني كه در اين راستا صورت گرفته است، در دهه گذشته تلاش‏هايي براي بررسي اثرات رژيم مورد بحث بر روي رفتار سلول‏ها انجام شده است. اين روش اخيرا بعنوان يكي از ساز و كارهاي تحريك مكانيكي سلول‏هاي مزانشيمي شناخته شده است. دستگاه اعمال ارتعاشات مكانيكي بر سلول‌هاي كشت داده شده به منظور بررسي تاثير اين نوع بارگذاري مكانيكي بر رفتار سلول‏ها طراحي و ساخته شده است. با استفاده از اين دستگاه، مي‏توان ارتعاشات مكانيكي عمودي را بصورت يكنواخت در بازه فركانسي 50 تا 350 هرتز در زمان تعيين شده به سلول‏ها اعمال نمود. اطلاعات ارتعاشات مكانيكي (شتاب ثبت شده با سرعت نمونه برداري 800 نمونه در هر ثانيه) به كمك نرم افزار كامپيوتري قابل ثبت مي‏باشد. با استفاده از ثبت اين داده¬ها و رسم نمودارهاي زماني و محتواي فركانسي سيگنال شتاب و دامنه ارتعاش، ميزان دامنه شتاب و ارتعاش در فركانس¬هاي مختلف تعريف شده توسط كاربر قابل مشاهده است. براي حفظ شرايط رشد سلولها، دستگاه به گونه اي طراحي شده است كه توانايي كار در شرايط داخل انكوباتور (دماي cº37، 5% CO2 و رطوبت بالا) را داشته باشد. به كمك اين دستگاه مي توان نحوه تمايز سلولهاي بنيادين به سلولهاي استخواني و غضروفي را بررسي نمود و اين دستگاه قابليت كاركرد در حوزه سلولهاي بنيادي و مهندسي بافت را دارا است.

اختراع در ارتباط با فناوري نانو دارو رساني است. در اين فناوري تلاش مي شود با محبوس كردن دارو درون حامل هاي مناسب سبب افزايش كارايي درمانيدارو از طريق تاخير در پاكسازي آنها از جريان خون، محافظت از دارو در محيط زيستي، محدودكردن اثرات دارو تنها به سلول هاي هدف وافزايش پايداري داروي به دام افتاده شد. در اين اختراع ما با افزودن پلي اتيلن گلايكول 3000 دالتون به نانو حامل نيوزومي توانستيم مشكل بارگذاري پايين، سايز بزرگ ذرات و رهايش سريع دارو را تا حد قابل قبولي بهبود بخشيم. استفاده از هموژنايزر و سونيكاتور نيز در كاهش سايز ذرات تاثير چشمگيري داشتند.

در حال حاضر آنتي¬بادي¬هاي درماني به ¬همراه قطعات آنتي¬بادي Fab (antibody fragment) بخش عظيمي (حدود P) از بازار داروهاي پروتئيني را به خود اختصاص داده است و سريع¬ترين رشد را در صنايع دارويي نشان مي¬دهد. قبل از تكنولوژي DNA نوتركيب Fab از طريق سيستئين پروتئاز پاپائين ايجاد مي¬شد كه يك روش غير اختصاصي بود. در حال حاضر Fab بيشتر توسط تكنولوژي DNA نوتركيب توليد مي¬شود و چون گليكوزيله نيست بيان آن در E. coli نسبت به بيان IgG در سلول پستانداران اقتصادي¬تر است. حدود 0 داروهاي نوتركيب كه توسط وزارت غذا و داروي آمريكا و اروپا پذيرفته شده¬اند در E. coli توليد مي¬شود. البته بيان پروتئين در اين ميكروارگانيسم محدوديت¬هايي نيز دارد كه مهم¬ترين آن¬ها عدم تشكيل صحيح ساختار پروتئين به دليل ايجاد اجسام انكلوزيون نامحلول است. از بهترين راهكارها براي غلبه بر اين مشكل بيان پروتئين به¬صورت فيوژن است. SUMO Tag يكي از فيوژن¬هايي است كه علاوه بر مزاياي استفاده از اين تكنولوژي، به علت وجود پروتئاز اختصاصي كه ساختار سه بعدي آن را شناسايي مي¬كند، فاقد مشكل برش در پروتئين نوتركيب است. ليكن تاكنون به صورت دوگانه (dual SUMO) در بيان Fab fragment مورد ارزيابي قرار نگرفته است.در اين مطالعه به منظور بررسي افزايش بيان و محلوليت Fab در E. coli از anti-VEGF-A به عنوان مدل استفاده مي¬شود. اثرات فيوژن پروتئين SUMO در بيان سيتوپلاسمي Fab با طراحي وكتور Dual SUMO‌ براي اولين بار بررسي خواهد شد.

بروسلوز يكي از پنج بيماري شايع باكتريايي مشترك بين انسان و دام (زئونوز) در سراسر جهان بشمار مي آيد. بروسلوز انساني توسط بروسلا مليتنسيس، بروسلا آبورتوس، بروسلا سوييس و بروسلا كانيس ايجاد شده و اين باكتريها پاتوژن انساني بشمار مي آيند. ميزان شيوع جهاني و شدت بيماري حاصل از بروسلا مليتنسيس و آبورتوس بيش از سايرين مي باشد. بروسلوز انساني در تمام نقاط جهان ديده مي شود و بسياري از كشورهاي در حال توسعه از جمله ايران از نظر شيوع بروسلوز اندميك مي باشند. با وجود اهميت بروسلوز و ميزان بالاي شيوع آن در جهان، تلاش ها براي ساخت واكسن ايمن(safe) ومحافظت كننده(protective) جهت ايمن سازي انسان بي نتيجه بوده است. از مهمترين آنتي ژنهاي بروسلايي در طراحي واكسن، پروتئين ريبوزومي L7/L12 از بروسلا آبورتوس و Omp31 از بروسلا مليتنسيس هستند كه داراي خصوصيات ايمونوژنيك و محافظت كننده ميباشند. اندميك بودن ايران براي بروسلوز ، عدم وجود واكسن انساني، افزايش پاسخ ايمني در سيستم چند آنتي ژني و خصوصيت محافظت كنندگي آنتي ژن هاي Omp31 وL7/L12 ، نياز براي توليد واكسن انساني را بسيار ضروري ساخته است. لذا، اختراع حاضر با طراحي يك فيوژن پروتئين نوتركيب حاوي آنتي ژن L7/L12 و فرم كوتاه شده (Truncated) Omp31 به بررسي خصوصيات ايمونوژنيك و محافظت كننده پروتئين فيوژن نوتركيب در برابر عفونت با بروسلا مليتنسيس و آبورتوس پرداخته است.