خلاصه اختراع :

به منظور ایجاد تغییرات و رسیدن به پروموتری قوی و غیر حساس به عوامل مهاری دخیل در پدیده مهار كاتابولیتی، با استفاده از تكنیك PCR در دو ناحیه، كه احتمال داده می شد یكی توالی متصل شونده به سیگما فاكتور و دیگری ناحیه cre باشد، جهش ایجاد شد. به منظور بررسی دقیق اثر این جهش های هدف دار نیاز به وجود یك ژن گزارشگر بود. بدین منظور از ژن كیتیناز chiS استفاده شد. دلیل استفاده از این ژن به علت وجود آنتی بادی بر علیه این پروتئین و امكان انجام تكنیك وسترن بلاتینگ از یك سو و نیز بررسی فعالیت آنزیمی از سوی دیگر بود. به علاوه، این ژن بیان بیشتری نسبت به chil داشته و بنابراین به راحتی برای بررسی پروموتر طبیعی و دستكاری نشده قابل استفاده خواهد بود. در مرحله بعدی كار، دو پروموتر تغییر یافته از طریق SOEing PCR به ژن chiS متصل شدند. ژن chiS نیز به همراه پروموتر طبیعی و با استفاده از الگوی ژنومی و تكنیك PCR تكثیر شدند. بدین ترتیب سه قطعه ژنی متفاوت ساخته شد: قطعه ژنی حاوی ژن كیتیناز و ناحیه پروموتری دست نخورده (Upchi2)، ژن كیتیناز متصل به پروموتری كه ۳۴۲ جفت باز از آن حذف شده است( Upchil) وزن كیتیناز متصل به پروموتری فاقد ناحیه cre و ۲۶ جفت باز از بالادست آن (Upchi2Acresig) (شكل3) پس از تكثیر قطعات مورد نظر، این قطعات در ناقل پلاسمیدی pDHAFB كلون شدند. شكل ۴ نشان دهنده نقشه این پلاسمید است. از جمله ویژگی های این پلاسمید وجود دو ماركر انتخابی آنتی بیوتیكی، آمپی سیلین برای E. coli و كلرامفنیكل برای Bacillus subtilis ، است. همچنین، این وكتور پلاسمیدی قابلیت ورود به ژنوم در ناحیه ژن آمیلاز، یك ژن غیر ضروری را دارد كه این خود عاملی در جهت پایداری ژن هترولوگ مورد نظر و عدم نیاز به استفاده مداوم از آنتی بیوتیك جهت حفظ پلاسمید بود.