به منظور ايجاد تغييرات و رسيدن به پروموتري قوي و غير حساس به عوامل مهاري دخيل در پديده مهار كاتابوليتي، با استفاده از تكنيك PCR در دو ناحيه، كه احتمال داده مي شد يكي توالي متصل شونده به سيگما فاكتور و ديگري ناحيه cre باشد، جهش ايجاد شد. به منظور بررسي دقيق اثر اين جهش هاي هدف دار نياز به وجود يك ژن گزارشگر بود. بدين منظور از ژن كيتيناز chiS استفاده شد. دليل استفاده از اين ژن به علت وجود آنتي بادي بر عليه اين پروتئين و امكان انجام تكنيك وسترن بلاتينگ از يك سو و نيز بررسي فعاليت آنزيمي از سوي ديگر بود. به علاوه، اين ژن بيان بيشتري نسبت به chil داشته و بنابراين به راحتي براي بررسي پروموتر طبيعي و دستكاري نشده قابل استفاده خواهد بود. در مرحله بعدي كار، دو پروموتر تغيير يافته از طريق SOEing PCR به ژن chiS متصل شدند. ژن chiS نيز به همراه پروموتر طبيعي و با استفاده از الگوي ژنومي و تكنيك PCR تكثير شدند. بدين ترتيب سه قطعه ژني متفاوت ساخته شد: قطعه ژني حاوي ژن كيتيناز و ناحيه پروموتري دست نخورده (Upchi2)، ژن كيتيناز متصل به پروموتري كه ۳۴۲ جفت باز از آن حذف شده است( Upchil) وزن كيتيناز متصل به پروموتري فاقد ناحيه cre و ۲۶ جفت باز از بالادست آن (Upchi2Acresig) (شكل3) پس از تكثير قطعات مورد نظر، اين قطعات در ناقل پلاسميدي pDHAFB كلون شدند. شكل ۴ نشان دهنده نقشه اين پلاسميد است. از جمله ويژگي هاي اين پلاسميد وجود دو ماركر انتخابي آنتي بيوتيكي، آمپي سيلين براي E. coli و كلرامفنيكل براي Bacillus subtilis ، است. همچنين، اين وكتور پلاسميدي قابليت ورود به ژنوم در ناحيه ژن آميلاز، يك ژن غير ضروري را دارد كه اين خود عاملي در جهت پايداري ژن هترولوگ مورد نظر و عدم نياز به استفاده مداوم از آنتي بيوتيك جهت حفظ پلاسميد بود.

علاوه بر استفاده هاي نظامي گسترده و مقاصد تروريستي از سياه زخم بايد در نظر داشت كه گستردگي منطقه اي سياه زخم در بين احشام يك خطر جدي براي بسياري از كشورها بوده و مي باشد. شيوع باسيلوس آنتراسيس به صورت اندميك و فوق اندميك در بخش گسترده اي از جهان وجود دارد (شكل 1). همانطور كه در اين شكل ديده مي شود شيوع بيماري سياه زخم در كشور ما از سال 1998 تا سال 2003 از حالت اندميك به حالت اسپوراديك تبديل و نرخ آن كاهش يافته است و اين مي تواند به علت مراقبت هاي بهينه در قرنطينه واردات دام و يا مصرف گسترده واكسن دامي در كشور باشد. از طرفي شايد اين آمار موجب غفلت تصميم گيران عالي بهداشتي و سلامت در كشور شود. ايمونوتراپي با استفاده از آنتي بادي هاي منوكلونال يكي از موثرترين و ايمن ترين روش هاي درماني براي سم زدايي در افراد تازه مبتلا شده به سياه زخم مي باشد. آنتي بادي هاي منوكلونال موشي علاوه بر اين كه ابزار تحقيقاتي قوي هستند، موجب توسعه ي روش هاي تشخيصي و درماني شده اند. ولي كاربرد اين آنتي بادي ها به چند علت داراي محدوديت مي باشد. براي توليد انبوه آن احتياج به سيستم بيان يوكاريوتي هست، داراي وزن مولكولي نسبتاً بالاي هستند و مهم تر از همه اين كه در كاربردهاي درماني انساني بالقوه ايمونوژن هستند.

خلاصه اختراع: در تحقيقات متعددي، نقش فيوژن پروتئين هاي متشكل از چند قطعه آنتي ژنيك متفاوت به عنوان كانديداي واكسن چند زيرواحدي به اثبات رسيده است (Heppner TJ, Bonev AD, Nelson MT, 2005) و (Singh. AK, et al., 2014). در مورد آنتراكس مطالعات نشان داد كه بيان هر يك از آنتي ژن هاي PA، LF و EFبه تنهايي انجام شده و ايمونوژن بودن آنها مورد ارزايي قرار گرفته است، همچنين اثر سينرژيستي استفاده همزمان آنتي بادي منوكلونال بر عليه PA و LF گزارش شده است. در اين اختراع، استفاده از فانكشنال دُمين هاي آنتي ژن هاي باسيلوس آنتراسيس در يك فيوژن پروتئين سه گانه به نام ELP متشكل از PAD4، LFD1 و EFD1، به عنوان كانديد واكسن ايمني بخش با ايمني زايي مناسب بر عليه باسيلوس آنتراسيس در مدل حيواني (دام كوچك،خوكچه هندي) مي¬باشد.