استخوان يك بافت شديدا مينراليزه و ديناميك است و در يك تعادل پايدار (هومئوستاتيك) بطور مداوم دستخوش ساخت و تخريب قرار مي گيرد. چنانچه در شرايط پاتولوژيك، تخريب استخوان غالب گردد، ساختار استخوان تحليل و بازجذب مي گردد. بازآرايي استخوان (bone regeneration) يك فرآيند فيزيولوژيك هماهنگ و پيچيده است و عوامل مختلفي در اين بازسازي تعيين كننده هستند. در شرايط پيچيده كلينيكي مانند بازسازي آسيب ها در استخوان هاي بلند، تروما، عفونت ها، برداشت تومور و ناهنجاري هاي مادرزادي و يا مواردي مانند نكروز، آتروفي ، پوكي استخوان و جراحي هاي دهان و دندان ، فك و صورت، طي فرآيند ترميم، نياز به سنتز ميزان زياد استخوان مي باشد. براي تمام موارد فوق كه در آنها فرآيند بازسازي استخوان دچار نقص شده و يا ناكافي مي باشد، روش هاي درماني جايگزين وجود دارد كه مي توانند به تنهايي يا در تركيب با روش هاي ديگر، جهت بهبود اين شرايط مورد استفاده قرار گيرند. گرافت هاي حيواني (xenografts or xenotransplants) از گرافت هاي مناسب و پراستفاده در ترميم استخوان مي باشد كه مزايا و معايب آن درست مثل آلوگرافت مي باشد و بدليل محدوديت هاي زيادي كه در نمونه هاي اتوگرافت وجود دارد، تقريبا بهترين انتخاب در حال حاضر مي باشد. دو نوع زنوگرافت عمده تاييد شده براي اهداف ترميمي عمدتا از منابع گاوي و اسبي بدست مي آيد. انواع شتري آن تاكنون در دنيا براي اين منظور معرفي و توليد نشده است. لذا در اين كار، ما براي اولين بار انواع پودر ها و بلاك هاي اسفنجي و كورتيكال شتري را تهيه و ويژگي هاي فيزيكوشيميايي چهار گانه )شامل DSC، XRD، SEM و FTIR) آن در مقايسه با نوع گاوي تاييد شده در FDA آمريكا (OCS-B®)را مورد ارزيابي قرار داده ايم. با بهينه سازي روش هاي موجود در دنيا براي تهيه پودرهاي سراميكي استخوان طبيعي، ما در اين اختراع روشي را ارائه كرده ايم كه مشابه ترين ساختار را با انواع تاييد شده پودر استخوان گاوي بدست داده است.

خلاصه‌اي از توصيف اختراع؛ DNA پلي مرازها در فرايندهايي چون همانندسازي، نوتركيبي و ترميم آسيب هاي DNA در موجودات زنده درگيرند. بسياري از DNA پلي مرازها در هنگام همانندسازي DNA دقيق عمل مي كنند، هر چند در برخي موارد ايجاد يك خطا تنها راه براي حفظ سلول محسوب مي شود كه اين دسته از پلي مرازها را تحت عنوان پلي مرازهاي با صحت پايين يا مستعد خطا نامگذاري مي كنند. اعضاي اين گروه انعطاف پذيري بالايي در انتخاب سوبسترا از خود نشان مي دهند. در اين مطالعه خصوصيات ساختاري آنزيم KOD DNA Polymerase مورد بررسي قرار گرفت و رزيدوهاي مهم كاتاليتيك در دمين پلي مرازي و اگزونوكلئازي با استفاده از مطالعات تئوري تعيين گرديد. در يكي از جهش يافته ها يك لوپ سه آمينواسيدي موجود در ناحيه بين دو الفا هليكس در زيردمين انگشتان با يك لوپ پنج اسيدآمينه اي از DNAپلي مراز زتا (ζ) جابجا گرديد تا هم فعاليت اگزونوكلئازي كاهش يابد و هم با افزايش انعطاف پذيري هليكس هاي تشكيل دهنده زيردمين انگشتان نرخ خطا افزايش پيدا كند. فرم لئوفلايز شده از Master mix در حضور پرايمر به مدت دو هفته در دماي اتاق بررسي و بدون كاهش كارايي آنزيم مزيت اين ويال هاي لئوفلايز شده را در تست هاي تشخيصي اثبات كرد. جهت سنجش فعاليت پلي مرازي از PCR مقايسه اي و جهت تعيين صحت فعاليت از Real time PCR و forward mutation assay استفاده شد. نتايج نشان داد وارايانت موتانت نسبت به آنزيم طبيعي فعاليت اگزونوكلئازي و صحت فعاليت كمتري دارند. تغييرات ساختاري توسط شبيه سازي ديناميك مولكولي، روش هاي فلورسانس ذاتي و خارجي و دو رنگ نمايي حلقوي (CD) مورد مطالعه قرار گرفت.

خلاصه‌اي از توصيف اختراع؛ برچسب¬هاي تخليصي، ابزارهاي ساده¬اي هستند كه مي توان از آنها براي جدا كردن طيف گسترده¬اي از پروتئين¬هاي نوتركيب استفاده كرد. از جمله برچسب¬هاي تخليصي تازه كشف شده مي توان به پلي پپتيد شبه إلاستين (ELP) اشاره كرد. اين پلي پپتيد از تكرار نسبتاً زياد يك پنتاپپتيد با اسيد آمينه¬هاي آبگريز تشكيل مي شود. از ويژگي¬هاي منحصر به فرد اين پلي پپتيد رسوب در دماي محيط و در حضور غلظتي از نمك سولفات آمونيوم مي باشد. اين ويژگي، اين پلي پپتيد را براي جدا كردن انتخابي پروتئين¬هاي نوتركيب، حتي پروتئين¬هايي كه قبلاً به دليل حساس بودن به دما و غلظت بالاي نمكي به سادگي قابل تخليص نبودند، مناسب كرده است و ديگر نيازي به ستون كروماتوگرافي نيست. در انتهاي فرايند هاي توليد پروتئين هاي نوتركيب، پروتئين هدف بايد خالص و بدون برچسب باشد كه حذف برچسب¬هاي تخليصي يك مشكل اساسي در فرآيندهاي تخليص اين پروتئين¬ها مي باشد. در گذشته، از پروتئازها براي حذف برچسب¬ها استفاده مي شد كه اين روش علاوه بر هزينه سنگين آن، مشكلاتي نظير آسيب غير قابل پيش بيني پروتئازها بر روي پروتئين نوتركيب و همينطور حذف اين پروتئيازها را جهت بدست آوردن محصول خالص در برداشت. اينتئين¬ها (inteins) پروتئين¬هاي خود هيدروليز شونده¬اي هستند كه مي توان از آنها در برنامه¬هاي تخليص پرتئين¬ها به عنوان جايگزيني براي پروتئازها جهت حذف برچسب¬هاي تخليصي استفاده كرد. واكنش خود برشي اينتئين با تغيير دما و pH قابل كنترل است. بنابراين با تركيب ELP با اينتئين مي توان يك برچسب خود برش دهنده ساخت كه به طور اقتصادي تخليص پروتئين¬هاي نوتركيب را در مقياس¬هاي كوچك و بزرگ تسهيل كند. در اين پايان نامه از ELP-Int به عنوان برچسب خود برش دهنده جهت تخليص آنزيم اوريكاز، بدون استفاده از ستون كروماتوگرافي و ديگر روش¬هاي متداول، در ميزبان E. coli استفاده شد.

علاوه بر استفاده هاي نظامي گسترده و مقاصد تروريستي از سياه زخم بايد در نظر داشت كه گستردگي منطقه اي سياه زخم در بين احشام يك خطر جدي براي بسياري از كشورها بوده و مي باشد. شيوع باسيلوس آنتراسيس به صورت اندميك و فوق اندميك در بخش گسترده اي از جهان وجود دارد (شكل 1). همانطور كه در اين شكل ديده مي شود شيوع بيماري سياه زخم در كشور ما از سال 1998 تا سال 2003 از حالت اندميك به حالت اسپوراديك تبديل و نرخ آن كاهش يافته است و اين مي تواند به علت مراقبت هاي بهينه در قرنطينه واردات دام و يا مصرف گسترده واكسن دامي در كشور باشد. از طرفي شايد اين آمار موجب غفلت تصميم گيران عالي بهداشتي و سلامت در كشور شود. ايمونوتراپي با استفاده از آنتي بادي هاي منوكلونال يكي از موثرترين و ايمن ترين روش هاي درماني براي سم زدايي در افراد تازه مبتلا شده به سياه زخم مي باشد. آنتي بادي هاي منوكلونال موشي علاوه بر اين كه ابزار تحقيقاتي قوي هستند، موجب توسعه ي روش هاي تشخيصي و درماني شده اند. ولي كاربرد اين آنتي بادي ها به چند علت داراي محدوديت مي باشد. براي توليد انبوه آن احتياج به سيستم بيان يوكاريوتي هست، داراي وزن مولكولي نسبتاً بالاي هستند و مهم تر از همه اين كه در كاربردهاي درماني انساني بالقوه ايمونوژن هستند.

خلاصه اختراع: در تحقيقات متعددي، نقش فيوژن پروتئين هاي متشكل از چند قطعه آنتي ژنيك متفاوت به عنوان كانديداي واكسن چند زيرواحدي به اثبات رسيده است (Heppner TJ, Bonev AD, Nelson MT, 2005) و (Singh. AK, et al., 2014). در مورد آنتراكس مطالعات نشان داد كه بيان هر يك از آنتي ژن هاي PA، LF و EFبه تنهايي انجام شده و ايمونوژن بودن آنها مورد ارزايي قرار گرفته است، همچنين اثر سينرژيستي استفاده همزمان آنتي بادي منوكلونال بر عليه PA و LF گزارش شده است. در اين اختراع، استفاده از فانكشنال دُمين هاي آنتي ژن هاي باسيلوس آنتراسيس در يك فيوژن پروتئين سه گانه به نام ELP متشكل از PAD4، LFD1 و EFD1، به عنوان كانديد واكسن ايمني بخش با ايمني زايي مناسب بر عليه باسيلوس آنتراسيس در مدل حيواني (دام كوچك،خوكچه هندي) مي¬باشد.

تشكيل قابل پيش بيني يك سطح مشترك بين ايمپلنت و استخوان، هدف درمان در زمينه دندانپزشكي ايمپلنت مي‌باشد. بدين منظور، كميت و كيفيت مناسبي از استخوان ضروري و حائز اهميت است. عليرغم آن كه امروزه ايمپلنت ها به طور گسترده اي مورد استفاده قرار مي گيرند و نرخ باقي ماندن آن ها در دهان نيز در حد بالايي قرار دارد اما كاربرد ايمپلنت هاي دنداني منجر به عوارض بسياري نيز مي شود. برخي از اين عوارض عبارتند از واكنش هاي بافت هاي نرم محيط اطراف ايمپلنت، موكوزيت و پري ايمپلنتيتس، و تخريب پيش رونده استخوان محيط اطراف ايمپلنت. اين دسته از واكنش ها ناشي از تغييرات پيشرفته التهابي در بافت هاي محيطي است بگونه اي كه موارد نامعمول در بافت هاي حول ايمپلنت مي تواند عامل اصلي عدم موفقيت ايمپلنت محسوب گردد. مشكلات استخواني حول ايمپلنت در صورتي كه هيچگونه درماني براي آن صورت نپذيرد، مي تواند منجر به شكست درمان ايمپلنت شود. تكنيك هاي بازسازي هدايت شده استخوان براي درمان ضايعات استخواني اطراف ايمپلنت مورد استفاده قرار مي گيرد. تكنيك‌هاي جراحي ومواد متعددي براي ايجاد ساختار مناسب استخوان براي حفظ ايمپلنت‌هاي دنداني به كار گرفته شده است شامل تقويت پيوند بلوك(block) ، بازسازي هدايت شده استخوان(GBR)، شكافتگي لبه (splitting)و استخوان سازي افتراقي افقي(distraction). امروزه استفاده از فلزاتي نظير تيتانيوم و آلياژهاي آن براي مقاصد كاشت در بدن انسان استفاده مي شود. ترميم استخوان اطراف ايمپلنت شامل يك آبشار از وقايع بيولوژيكي سلولي و خارج سلولي مي باشد كه در فصل مشترك استخوان-ايمپلنت با بازسازي استخوان انجام مي گيرد. در اين تحقيق، ذرات كيتوسان(Cs) حاوي پلاكت غني از فيبرين (Cs/L-PRF)با روش پلي ساكاريد/دارو ساخته شد. سپس با روش الكتروفورتيك(EPD) بر روي سطح آلياژ تيتانيوم Ti-13Zr-13Nb پوشش داده شد. در اين پروژه كاربرد L-PRF سبب افزايش سرعت بازسازي استخوان مي شود و با كاهش اندازه ذرات كيتوسان ويژگي هاي بهتري نظير افزايش توانايي جذب، پوشش و قابليت پيوند كه نتيجه افزايش سطح تماس ذرات مي باشد، حاصل مي گردد. بنابراين، Ti-13Nb-13Zr پوشش دهي شده با ذرات Cs/L-PRF مي تواند گزينه مناسبي جهت كاربرد در ايمپلنت ها دندانپزشكي و ارتوپدي براي تحريك استخوان سازي باشد.

1- خلاصهاي از توصيف اختراع؛ در اين پروژه سعي در بيان، تخليص و تعيين ويژگي آنزيم مذكور با هدف استفاده از آن در روش MLPA شده است. به اين منظور ژن اين آنزيم با استفاده از وكتور pET28a به درون باكتري E.coli BL21 (DE3) ترانسفورم شد و تحت بيان و تخليص با روش كروماتوگرافي ميل تركيبي و رسوب حرارتي قرار گرفت. سپس فعاليت آنزيم به دو شيوه¬ي كيفي و كمي مورد آزمون قرار گرفت. در يكي از روش¬هاي كيفي قطعه¬ي BstEII-digested λ DNA مورد الحاق قرار گرفت و در آزمون ديگر از الحاق وكتور pHEN6 كه مورد هضم دوگانه با دو آنزيم محدودكننده قرار گرفته بود و يك قطعه insert واجد توالي برشي مربوط به آن دو آنزيم در دو سمت آن استفاده شد. جهت سنجش كمي فعاليت آنزيم نيز روشي با استفاده از سامانه¬ي بيوتين-استرپتاويدين-فلورسين طراحي شد. نتايج حاصل از فعاليت آنزيم نشان داد كه با گذشت زمان ميزان نشر متناظر براي سوبسترا افزايش مي¬يابد. با توجه به هدف اصلي پژوهش، از آنزيم مذكور در كيت MLPA نيز استفاده شد كه نتايج حاكي از فعاليت نسبي اين آنزيم در كيت مذكور بود.

فاكتور رشد مشتق از پلاكت(PDGF) در سال 1997 به عنوان يك فاكتور سرم وابسته به پلاكت شناخته شد كه مي¬تواند باعث تحريك تكثير فيبروبلاست، سلول¬هاي عضلاني صاف عروقي و سلول¬هاي گليال شود. خانواده PDGF از چهار زنجيره پلي¬پپتيدي مختلف تشكيل شده¬اند، زنجيره¬هاي كلاسيك(PDGF-A و PDGF-B) و زنجيره¬هاي جديد(PDGF-C وPDGF-D). چهار PDGF در فرم¬هاي مونومر غير فعال هستند به همين دليل همه ليگاندهاي PDGF همودايمراند كه با پيوندهاي دي سولفيدي به يكديگر متصل مي¬شوند و تنها PDGF-A و PDGF-B مي¬توانند هترودايمرهاي كارامد و عملكردي را تشكيل بدهند. پنج نوع ايزوفرم PDGF پيام رساني خود را از طريق دو گيرنده تيروزين كينازي به نام هاي PDGFRα وPDGFRβ كه بسيار مشابه هستند اغاز مي¬كنند. به دليل نقش PDGF در تكثير و مهاجرت سلولي تصور مي¬شود كه آنها¬ در التيام زخم و ترميم بافتي نيز دخيل باشند و در نتيجه اين موضوع آنها را به اهداف درماني قابل توجه تبديل مي¬كند. همچنين مطالعات باليني روي PDGF-BB نشان داده است كه تجويز خارجي آن داراي توان بالقوه براي التيام زخم مي¬باشد. از اين رو فاكتور رشد پلاكتي به صورت دايمر و نوتركيب به عنوان ماده زيستي فعال چندين دارو به نام هاي Regranex، Augment وGME21s مورد استفاده قرار گرفت. از طرفي در كارآزمايي¬هاي باليني مشاهده شد كه ميزان مرگ و مير در اثر توسعه تومور در بيماراني كه بيش از سه دوره از داروي رگرانكس را مورد استفاده قرار داده اند را تا شش برابر افزايش داده است. به همين دليل محققين به فكر يك روش جايگزين براي استفاده ازPDGF افتادند. اين روش جايگزين استفاده از پپتيدهاي مشتق از PDGF بود كه از اين ميان PBA2-1C توانست تا حدودي به عنوان اگونيست گيرنده بتاي PDGF عمل كند و باعث افزايش تكثير سلول شود. به همين دليل در اين پروژه با هدف ساخت يك پپتيد جديد نه به صورت يك تك زنجيره پپتدي مثل ساير پژوهش هايي كه تاكنون در دنيا متداول بوده است بلكه دقيقا با استفاده از لوپ هاي ديمر PDGF درگير در واكنش با گيرنده بتاي PDGF، مبناي طراحي و انتخاب الگو براي ساخت يك پپتيد همجوش با دو بخش تكراري مورد استفاده قرار گرفت. همچنين با هدف تثبيت پپتيد همجوش رو بستر هيدروكسي اپاتيت يا بستر استخواني به جاي توالي متصل شونده به هپارين از توالي متصل شونده به هيدروكسي اپاتيت استفاده كرديم.

با توجه به آمار روز افزون شيوع سرطان در جوامع بشري لزوم تحقيقات در زمينه پيدا كردن راه هاي درماني موثرتر، امري ضروري مي باشد. بخصوص اثرات جانبي كه از راديوتراپي، شيمي درماني و.. ايجاد مي شوند ضرورت اين امر را پر رنگ تر مي كند. ايمونوتراپي با استفاده از آنتي بادي هاي منوكلونال يكي از موثرترين روش هاي درماني براي سرطان مي باشد. ولي كاربرد آنتي بادي¬هاي موشي به چند علت داراي محدوديت مي باشد. داراي وزن مولكولي نسبتا بالاي هستند و در كاربردهاي درماني انساني بالقوه ايمونوژن مي باشند. يكي از راه حل هاي پيشنهادي استفاده از پپتيدهاي مشتق از آنتي بادي ها از جمله VHHهاي شتري مي باشد. كلون كردن VHHدر يك وكتور نمايش فاژ، انتخاب قطعه اتصالي به آنتي ژن بوسيله غني سازي و بيان VHH در باكتري ها بعنوان يك جايگزين ارزشمند براي به دست آوردن مولكول كوچك شناساگر است. VHH هاي به دست آمده از شترهاي ايمن شده در مقايسه با Fab ، Fv وscFV كه از ساير پستانداران بدست آمده اند، برترهاي قابل ملاحظه اي دارد. از اينرو با توجه به نقش آنتي بادي هاي اگونيست عليه DR5، جهت القائ آپوپتوز در سلول¬هاي سرطاني، هدف از اين تحقيق توليد نانوبادي¬هاي شتري (VHH) عليه گيرنده DR5 بوده است.