خلاصه‌اي از توصيف اختراع؛ DNA پلي مرازها در فرايندهايي چون همانندسازي، نوتركيبي و ترميم آسيب هاي DNA در موجودات زنده درگيرند. بسياري از DNA پلي مرازها در هنگام همانندسازي DNA دقيق عمل مي كنند، هر چند در برخي موارد ايجاد يك خطا تنها راه براي حفظ سلول محسوب مي شود كه اين دسته از پلي مرازها را تحت عنوان پلي مرازهاي با صحت پايين يا مستعد خطا نامگذاري مي كنند. اعضاي اين گروه انعطاف پذيري بالايي در انتخاب سوبسترا از خود نشان مي دهند. در اين مطالعه خصوصيات ساختاري آنزيم KOD DNA Polymerase مورد بررسي قرار گرفت و رزيدوهاي مهم كاتاليتيك در دمين پلي مرازي و اگزونوكلئازي با استفاده از مطالعات تئوري تعيين گرديد. در يكي از جهش يافته ها يك لوپ سه آمينواسيدي موجود در ناحيه بين دو الفا هليكس در زيردمين انگشتان با يك لوپ پنج اسيدآمينه اي از DNAپلي مراز زتا (ζ) جابجا گرديد تا هم فعاليت اگزونوكلئازي كاهش يابد و هم با افزايش انعطاف پذيري هليكس هاي تشكيل دهنده زيردمين انگشتان نرخ خطا افزايش پيدا كند. فرم لئوفلايز شده از Master mix در حضور پرايمر به مدت دو هفته در دماي اتاق بررسي و بدون كاهش كارايي آنزيم مزيت اين ويال هاي لئوفلايز شده را در تست هاي تشخيصي اثبات كرد. جهت سنجش فعاليت پلي مرازي از PCR مقايسه اي و جهت تعيين صحت فعاليت از Real time PCR و forward mutation assay استفاده شد. نتايج نشان داد وارايانت موتانت نسبت به آنزيم طبيعي فعاليت اگزونوكلئازي و صحت فعاليت كمتري دارند. تغييرات ساختاري توسط شبيه سازي ديناميك مولكولي، روش هاي فلورسانس ذاتي و خارجي و دو رنگ نمايي حلقوي (CD) مورد مطالعه قرار گرفت.

خلاصه‌اي از توصيف اختراع؛ برچسب¬هاي تخليصي، ابزارهاي ساده¬اي هستند كه مي توان از آنها براي جدا كردن طيف گسترده¬اي از پروتئين¬هاي نوتركيب استفاده كرد. از جمله برچسب¬هاي تخليصي تازه كشف شده مي توان به پلي پپتيد شبه إلاستين (ELP) اشاره كرد. اين پلي پپتيد از تكرار نسبتاً زياد يك پنتاپپتيد با اسيد آمينه¬هاي آبگريز تشكيل مي شود. از ويژگي¬هاي منحصر به فرد اين پلي پپتيد رسوب در دماي محيط و در حضور غلظتي از نمك سولفات آمونيوم مي باشد. اين ويژگي، اين پلي پپتيد را براي جدا كردن انتخابي پروتئين¬هاي نوتركيب، حتي پروتئين¬هايي كه قبلاً به دليل حساس بودن به دما و غلظت بالاي نمكي به سادگي قابل تخليص نبودند، مناسب كرده است و ديگر نيازي به ستون كروماتوگرافي نيست. در انتهاي فرايند هاي توليد پروتئين هاي نوتركيب، پروتئين هدف بايد خالص و بدون برچسب باشد كه حذف برچسب¬هاي تخليصي يك مشكل اساسي در فرآيندهاي تخليص اين پروتئين¬ها مي باشد. در گذشته، از پروتئازها براي حذف برچسب¬ها استفاده مي شد كه اين روش علاوه بر هزينه سنگين آن، مشكلاتي نظير آسيب غير قابل پيش بيني پروتئازها بر روي پروتئين نوتركيب و همينطور حذف اين پروتئيازها را جهت بدست آوردن محصول خالص در برداشت. اينتئين¬ها (inteins) پروتئين¬هاي خود هيدروليز شونده¬اي هستند كه مي توان از آنها در برنامه¬هاي تخليص پرتئين¬ها به عنوان جايگزيني براي پروتئازها جهت حذف برچسب¬هاي تخليصي استفاده كرد. واكنش خود برشي اينتئين با تغيير دما و pH قابل كنترل است. بنابراين با تركيب ELP با اينتئين مي توان يك برچسب خود برش دهنده ساخت كه به طور اقتصادي تخليص پروتئين¬هاي نوتركيب را در مقياس¬هاي كوچك و بزرگ تسهيل كند. در اين پايان نامه از ELP-Int به عنوان برچسب خود برش دهنده جهت تخليص آنزيم اوريكاز، بدون استفاده از ستون كروماتوگرافي و ديگر روش¬هاي متداول، در ميزبان E. coli استفاده شد.

علاوه بر استفاده هاي نظامي گسترده و مقاصد تروريستي از سياه زخم بايد در نظر داشت كه گستردگي منطقه اي سياه زخم در بين احشام يك خطر جدي براي بسياري از كشورها بوده و مي باشد. شيوع باسيلوس آنتراسيس به صورت اندميك و فوق اندميك در بخش گسترده اي از جهان وجود دارد (شكل 1). همانطور كه در اين شكل ديده مي شود شيوع بيماري سياه زخم در كشور ما از سال 1998 تا سال 2003 از حالت اندميك به حالت اسپوراديك تبديل و نرخ آن كاهش يافته است و اين مي تواند به علت مراقبت هاي بهينه در قرنطينه واردات دام و يا مصرف گسترده واكسن دامي در كشور باشد. از طرفي شايد اين آمار موجب غفلت تصميم گيران عالي بهداشتي و سلامت در كشور شود. ايمونوتراپي با استفاده از آنتي بادي هاي منوكلونال يكي از موثرترين و ايمن ترين روش هاي درماني براي سم زدايي در افراد تازه مبتلا شده به سياه زخم مي باشد. آنتي بادي هاي منوكلونال موشي علاوه بر اين كه ابزار تحقيقاتي قوي هستند، موجب توسعه ي روش هاي تشخيصي و درماني شده اند. ولي كاربرد اين آنتي بادي ها به چند علت داراي محدوديت مي باشد. براي توليد انبوه آن احتياج به سيستم بيان يوكاريوتي هست، داراي وزن مولكولي نسبتاً بالاي هستند و مهم تر از همه اين كه در كاربردهاي درماني انساني بالقوه ايمونوژن هستند.

خلاصه اي از توصيف اختراع؛ در شرايط پيچيده كلينيكي مانند بازسازي آسيب ها در بافت هاي مختلف بويژه استخوان ها، تروما، عفونت ها، برداشت تومور وناهنجاري هاي مادرزادي و يا مواردي مانند نكروز، آتروفي ، پوكي استخوان و جراحي هاي دهان و دندان، جمجمه و فك و صورت، طي فرآيند ترميم، نياز به سنتز ميزان زياد استخوان و بافت نرم مي باشد. براي تمام موارد فوق كه در آنها فرآيند بازسازي بافتي خصوصا" استخوان دچار نقص شد و يا ناكافي مي باشد، روش هاي درماني جايگزين وجود دارد كه مي توانند به تنهايي يا در تركيب با روشهاي ديگر، جهت بهبود اين شرايط مورد استفاده قرار گيرند. گرافت هاي استخواني و محصولات كلاژني تقريبا" در تمام موارد فوق استفاده مي شوند. در خصوص كلاژن و محصولات بدست آمد از آن حتي استفاده در پزشكي ترميمي و زيبايي بسيار بيشتر مي باشد. كلاژن علاوه بر مصارف بسيار زياد در صنايع مختلف، بدليل خواص بيولوژيك ويژه در پزشكي خصوصا" در پزشكي بازساختي مورد استفاده زيادي دارد. در چند سال گذشته با توسعه روشهاي طب زيبايي برندهاي متفاوتي از انواع كلاژن و مواد مشتق و يا كامپوزيت از آن به كلينيك را پيدا كرده اند. در تجارت پرسود كلاژن، بسياري از كمپاني هاي نوظهور نيز اقدام به توليد كلاژن كرد و متاسفانه كيفيت هاي بد بسياري از اين محصولات باعث مشكلات عديده اي در استفاده كنندگان از كلاژن تبديل شده است. علاوه بر مصرف جراحي، بدليل توسعه انفجاري مطب هاي زيبايي در كشور و رقابت ناسالم در اين حوزه ، انواع غير استاندارد كلاژن در ايران وارد شده است. متاسفانه هنوز در ايران منابعي براي تامين داخلي كلاژن با استاندارد درماني و زيبايي وجود نداشته لذا ما در اين پروژه ما علاو بر بهينه سازي روش توليد كلاژن شترمرغي براي اولين بار منبع جديد كلاژن تاندوني شتري را معرفي و بر اساس بعضي از آزمايشات مندرج در مفاد ايزو 11003 برخي خصوصيات فيزيكوشيميايي با تمركز بر تعيين خلوص، ويژگي ساختاري،مورفولوژي سطح، pH و ... آن را تعيين ويژگي كرده ايم. همچنين از آنجاييكه تاكنون گزارشي از ثبت اختراع يا گزارش علمي در خصوص كلاژن شتري در مراكز ثبت اختراع اروپا و آمريكا وجود نداشت ما را بر آن داشت تا ضمن ارائه روش مناسب، از منابع تاندون شتري براي توليد كلاژن تيپ 1 اقدام و آن را تعيين ويژگي نماييم. در اين رابطه از نمونه كلاژن شركت NIBEC كره جنوبي با نام تجاري GuidOss® كه علاو بر تاييديه اروپا (CE) ، تاييديه FDA آمريكا را هم كسب نمود است را به عنوان نمونه استاندارد ، انتخاب و تمام نتايج آزمايشات كلاژن شتري و شترمرغي در اين پروژه را با اين نمونه مقايسه كرده ايم. طبق استاندارد ايزو 11003 اولين آزمايشات براي تاييد همه تجهيزات بكار رفته در پزشكي بايد تاييديه Invitro را كسب كرده باشد و مقدم بر همه روش هاي Invitro، بررسي ساختار و برخي ويژگي هاي اصلي كلاژن كه نشان دهنده خلوص بر معناي مراد آن استاندارد باشد، است.لذا براي ارزيابي كلاژن بدست آمد در اين طرح، در همه موارد مندرج در بخش نتايج، در مقايسه با كلاژن استاندارد نتايج قابل قبولي داشته و لذا از اين دو نوع كلاژن مي توان بعد از انجام برخي تست هاي ميكروبي و سلولي، در مطالعه حيواني استفاده كرد.

خلاصه اختراع: در تحقيقات متعددي، نقش فيوژن پروتئين هاي متشكل از چند قطعه آنتي ژنيك متفاوت به عنوان كانديداي واكسن چند زيرواحدي به اثبات رسيده است (Heppner TJ, Bonev AD, Nelson MT, 2005) و (Singh. AK, et al., 2014). در مورد آنتراكس مطالعات نشان داد كه بيان هر يك از آنتي ژن هاي PA، LF و EFبه تنهايي انجام شده و ايمونوژن بودن آنها مورد ارزايي قرار گرفته است، همچنين اثر سينرژيستي استفاده همزمان آنتي بادي منوكلونال بر عليه PA و LF گزارش شده است. در اين اختراع، استفاده از فانكشنال دُمين هاي آنتي ژن هاي باسيلوس آنتراسيس در يك فيوژن پروتئين سه گانه به نام ELP متشكل از PAD4، LFD1 و EFD1، به عنوان كانديد واكسن ايمني بخش با ايمني زايي مناسب بر عليه باسيلوس آنتراسيس در مدل حيواني (دام كوچك،خوكچه هندي) مي¬باشد.

1- خلاصهاي از توصيف اختراع؛ در اين پروژه سعي در بيان، تخليص و تعيين ويژگي آنزيم مذكور با هدف استفاده از آن در روش MLPA شده است. به اين منظور ژن اين آنزيم با استفاده از وكتور pET28a به درون باكتري E.coli BL21 (DE3) ترانسفورم شد و تحت بيان و تخليص با روش كروماتوگرافي ميل تركيبي و رسوب حرارتي قرار گرفت. سپس فعاليت آنزيم به دو شيوه¬ي كيفي و كمي مورد آزمون قرار گرفت. در يكي از روش¬هاي كيفي قطعه¬ي BstEII-digested λ DNA مورد الحاق قرار گرفت و در آزمون ديگر از الحاق وكتور pHEN6 كه مورد هضم دوگانه با دو آنزيم محدودكننده قرار گرفته بود و يك قطعه insert واجد توالي برشي مربوط به آن دو آنزيم در دو سمت آن استفاده شد. جهت سنجش كمي فعاليت آنزيم نيز روشي با استفاده از سامانه¬ي بيوتين-استرپتاويدين-فلورسين طراحي شد. نتايج حاصل از فعاليت آنزيم نشان داد كه با گذشت زمان ميزان نشر متناظر براي سوبسترا افزايش مي¬يابد. با توجه به هدف اصلي پژوهش، از آنزيم مذكور در كيت MLPA نيز استفاده شد كه نتايج حاكي از فعاليت نسبي اين آنزيم در كيت مذكور بود.

فاكتور رشد مشتق از پلاكت(PDGF) در سال 1997 به عنوان يك فاكتور سرم وابسته به پلاكت شناخته شد كه مي¬تواند باعث تحريك تكثير فيبروبلاست، سلول¬هاي عضلاني صاف عروقي و سلول¬هاي گليال شود. خانواده PDGF از چهار زنجيره پلي¬پپتيدي مختلف تشكيل شده¬اند، زنجيره¬هاي كلاسيك(PDGF-A و PDGF-B) و زنجيره¬هاي جديد(PDGF-C وPDGF-D). چهار PDGF در فرم¬هاي مونومر غير فعال هستند به همين دليل همه ليگاندهاي PDGF همودايمراند كه با پيوندهاي دي سولفيدي به يكديگر متصل مي¬شوند و تنها PDGF-A و PDGF-B مي¬توانند هترودايمرهاي كارامد و عملكردي را تشكيل بدهند. پنج نوع ايزوفرم PDGF پيام رساني خود را از طريق دو گيرنده تيروزين كينازي به نام هاي PDGFRα وPDGFRβ كه بسيار مشابه هستند اغاز مي¬كنند. به دليل نقش PDGF در تكثير و مهاجرت سلولي تصور مي¬شود كه آنها¬ در التيام زخم و ترميم بافتي نيز دخيل باشند و در نتيجه اين موضوع آنها را به اهداف درماني قابل توجه تبديل مي¬كند. همچنين مطالعات باليني روي PDGF-BB نشان داده است كه تجويز خارجي آن داراي توان بالقوه براي التيام زخم مي¬باشد. از اين رو فاكتور رشد پلاكتي به صورت دايمر و نوتركيب به عنوان ماده زيستي فعال چندين دارو به نام هاي Regranex، Augment وGME21s مورد استفاده قرار گرفت. از طرفي در كارآزمايي¬هاي باليني مشاهده شد كه ميزان مرگ و مير در اثر توسعه تومور در بيماراني كه بيش از سه دوره از داروي رگرانكس را مورد استفاده قرار داده اند را تا شش برابر افزايش داده است. به همين دليل محققين به فكر يك روش جايگزين براي استفاده ازPDGF افتادند. اين روش جايگزين استفاده از پپتيدهاي مشتق از PDGF بود كه از اين ميان PBA2-1C توانست تا حدودي به عنوان اگونيست گيرنده بتاي PDGF عمل كند و باعث افزايش تكثير سلول شود. به همين دليل در اين پروژه با هدف ساخت يك پپتيد جديد نه به صورت يك تك زنجيره پپتدي مثل ساير پژوهش هايي كه تاكنون در دنيا متداول بوده است بلكه دقيقا با استفاده از لوپ هاي ديمر PDGF درگير در واكنش با گيرنده بتاي PDGF، مبناي طراحي و انتخاب الگو براي ساخت يك پپتيد همجوش با دو بخش تكراري مورد استفاده قرار گرفت. همچنين با هدف تثبيت پپتيد همجوش رو بستر هيدروكسي اپاتيت يا بستر استخواني به جاي توالي متصل شونده به هپارين از توالي متصل شونده به هيدروكسي اپاتيت استفاده كرديم.

دراين نوآوري سعي شده است با طراحي شكل جديدي كه در ناحيه اباتمنت صورت گرفته است و در اين اختراع تحت عنوان sliced Matrix ناميده مي شود، دندانپزشك قادر باشد تا به راحتي با استفاده از روش هاي متداول دندانپزشكي كه post و core ناميده مي شود، اباتمنت را با زاويه و ارتفاع دلخواه در دهان بيمار خود تنظيم نمايد. روش كار به اين صورت است كه دندانپزشك با ايجاد انحناي مناسب در پره هاي sliced Matrix و ايجاد يك ماتريكس مناسب با زاويه دلخواه و به كارگيري مواد core build up مي تواند قسمت superstructure ايمپلنت را شكل دهي نمايد. سپس با روش هاي متداول از اباتمنت خود قالب گيري و قالب خود را به لابراتوار ارسال نمايد. در اين روش با حذف روش هاي پيچيده قالب گيري و لابراتوآري و اجزاء مختلفي كه در مراحل ساخت پروتز ايمپلنت مورد نياز است، دندانپزشك به راحتي قادر خواهد بود تا نسبت به ساخت پروتز ايمپلنت خود اقدام نمايد. مزاياي بسياري بر اين نوآوري مترتب است كه در بخش “بيان واضح و دقيق مزاياي اختراع ادعايي” بطور مبسوط در متن اختراع به آن اشاره شده است.