باكتري Ecoli,BL-21(DE3 به عنوان يك ميزبان بياني حاوي وكتور نوتركيب pET-28alflic قادر است پروتئين فلاژلين نوتركيب سودوموناس آنروژينوزا را با وزن مولكولي 46kD توليد نمايد. در صورتي كه اين باكتري در محيط LB براث حاوي آنتي بيوتيك كانامايسين 30Mg/ml كشت داده شود و با غلظت 1mM از IPTG القاء گردد پس از انكوباسيون 4 ساعته در 37C مي تواند به ميزان زيادي فلاژلين نوتركيب را توليد نمايد. فلاژلين توليدي با ليز باكتري قابل استحصال بوده و با رزين نيكلي به شكل خالصي تخليص مي گردد. تشابه ساختار آنتي ژنيك اين پروتئين با فلاژلين طبيعي در آزمايش وسترن بلات به اثبات رسيده و آنتي بادي عليه آن قادر است در شرايط آزمايشگاهي حركت باكتري را مهار كند. بنابراين در برنامه هاي واكسيناسيون مي تواند جايگزين فرم طبيعي آن گردد.

هدف از اين اختراع طراحي و ساخت باكتري است تا با استفاده از آن بتوان مقادير قابل توجهي پروتئين نوتركيب زير واحد B ويبريو كلرا را تهيه نمود. در ابتدا DNAي ويبريو كلره به روش فنل-كلروفورم استخراج و ژن ctxB با استفاده از پرايمرهاي طراحي شده واجد سايت برش آنزيمي تكثير داده شده. سپس وكتور pET-28a از باكتري هاي واجد آن استخراج و همراه قطعه ctxB تكثير يافته هضم دوگانه با استفاده از آنزيم هاي Hind III و Xho I انجام گرفت. در ادامه وكتور و قطعه هضم شده با استفاده از آنزيم ليگار عمل ليگيشن روي آنها انجام شد تا قطعه ctxB وارد وكتور مورد نظر شود. سپس وكتور به سلول هاي DH5α ترانسفورم شده و پس از تكثير از سلول هاي مورد نظر استخراج و وارد سلول هاي بياني BL21 شد. در انتها پس از تكثير باكتري هاي نوتركيب و القا با IPTG پروتئين CTB نوتركيب بيان شد كه در ادامه با SDS-PAGE و وسترن بلاتينگ تأئيد شد.

وكتور نوتركيب pET-28alflic پلاسميدي بياني است كه در محل دو آنزيم محدود الاثر Ncoi و Xhol ژن توليد كننده فلاژلين سودوموناس آنروژينوزا flic را در خود جاي داده است اين وكتور حاوي ژن مقاومت به آنتي بيوتيك كانامايسين است كه با اضافه كردن كاتامايسين به محيط كشت باكتريايي كلون هاي دريافت كننده اين وكتور قادر به رشد خواهند بود. وكتور pET-28alflic داراي پروموتور فاز T7 است و تحت آنزيم RNA پلي مراز فاز DE3 از ژن flic رونويسي مي كند. در ناحيه c- انتهايي ژن فلاژلين اين وكتور 6 توالي هيستيديني قرار مي گيرد كه باعث تسهيل در تخليص پروتئين نوتركيب با استفاده از رزين نيكل مي گردد.

هدف از اين اختراع طراحي و ساخت وكتوري است تا با استفاده از آن بتوان مقادير قابل توجهي پروتئين نوتركيب زير واحد B سو ويبريو كلرا را تهيه نمود. در ابتدا DNA ي ويبريو كلره به روش فنل - كلروفورم استخراج و ژن ctxB با استفاده از پرايمرهاي طراحي شده واجد سايت برش آنزيمي تكثير داده شد. سپس وكتور pET-28a از باكتري هاي واجد آن استخراج و همراه قطعه ctxB تكثير يافته هضم دوگانه با استفاده از آنزيم هاي Hind IIIو XhoI انجام گرفت. در ادامه وكتور و قطعه هضم شده با استفاده از آنزيم ليگار عمل ليگيشن روي آنها انجام شد تا قطعه ctxB وارد وكتور مورد نظر شود. در انتها با انجام الكتروفورز و PCR برروي پلاسميد تهيه شده توليد پلاسميد نوتركيب تائيد شد.