اختراع \\\\\\\\\\\\\\" توليد آنتي ژن نوتركيب HA1 ويروس آنفلوانزاي H5N1 در گياه كاهو (Lactuca sativa) به منظور توليد واكسن بيماري\\\\\\\\\\\\\\" در زمينه فني: بخش الف: نياز هاي انساني، زير بخش: سلامتي و بهداشت توليد واكسن هاي نوتركيب زمينه اي نسبتاً نوظهور و البته اميدواركننده در حوزه بيوتكنولوژي به حساب مي آيد. از ميان سيستم هاي مختلف بياني كه تاكنون براي توليد واكسن نوتركيب مورد استفاده قرار گرفته اند، سيستم هاي گياهي به دلايلي مانند ماهيت يوكاريوتي، هزينه نسبتاً پايين توليد و عدم آلودگي به پاتوژن هاي انساني و دامي مورد توجه بسياري از محققان قرار گرفته اند. آنفلوانزاي پرندگان يكي از بيماري هاي ويروسي مهم است كه اهميت جهاني داشته و موجب خسارت اقتصادي بالايي در صنايع ماكيان مي شود. اين ويروس پتانسيل ايجاد بيماريزايي شديد در ماكيان، پستانداران و همچنين انسان را دارد. هزينه بالاي توليد و خطر فعال شدن ويروس هاي ضعيف شده در واكسن هاي سنتي باعث شده است كه توليد واكسن نوتركيب اين بيماري مورد توجه قرار گيرد. هم اكنون واكسن‌هاي تجاري بسياري با چرخه توليد طولاني و عدم پاسخ گويي مناسب در مقابل پاندمي ها براي مقابله با اين بيماري استفاده مي‌شوند اما واكسن نوتركيب HA1 توليدي در گياه با قابليت توليد حجم بالاي پروتئين در مدت زمان اندك و بصورت مقرون به صرفه قادر است در زمان مواجهه با خطر پاندمي H5N1، تا زمان ساخته شدن واكسن اختصاصي سويه به منظور كاهش عوارض باليني مورد استفاده قرار گيرد. عمده واكسن هاي مورد استفاده چه واكسن هاي نوتركيب و چه واكسن هاي مرسوم تجاري داراي بخش هاي آنتي ژني غيرضروري هستند كه موجب افزايش زمان ايمني زايي و هزينه هاي توليد مي شوند اما واكسن نوتركيب HA1 كه زيرواحد اصلي گليكوپروتئين غشاء ويروس يعني هماگلوتنين است بدليل وزن ملكولي پائين و توان آنتي ژنيسيتي بالا، قادر به جايگزيني پروتئين كامل بوده و كانديد جذابي است كه توليد آنتي بادي هاي خنثي كننده ويروس آنفلوانزا را القا كند. اين آنتي ژن با داشتن ويژگي ايميونوژنيسيتي بالا، باعث القاي پاسخ ايمني در بدن ميزبان مي شود و از ورود ويروس بدرون سلول ميزبان و تكثير آن ممانعت بعمل مي آورد و با بيان اين آنتي ژن در گياه كاهو، مي‌توان پروتئين نوتركيبي كه باعث افزايش سيستم ايمني حيوان و انسان مي‌شود، توليد نمود. بنابراين كانديد مناسبي براي توليد واكسن نوتركيب محسوب مي شود. در اين اختراع، آنتي ژن HA1 به عنوان زيرواحد بزرگ پروتئين هماگلوتنين ويروس آنفلوانزاي H5N1 بطور پايدار از طريق سيستم تراريختگي مبتني بر اگروباكتريوم در گياه كاهو بيان شد. به منظور بررسي امكان بيان پروتئين HA1 در سيستم گياهي، توالي كدكننده آنتي ژن HA1 بهينه سازي شده، سنتز و با افزودن توالي كوزاك، تگ هيستيدين و پپتيدهاي راهنماي KDEL و ZERA مورد تغيير قرار گرفت (شكل شماره 1). در اختراع حاضر، ارزيابي پايداري و وراثت پذيري آنتي ژن HA1 در لاين هاي تراريخته كاهو بر اساس آزمون مقاومت به كانامايسين و PCR در نسل هاي اول، دوم و سوم انجام شده و بيان ترانسژن در آن ها در سطح رونويسي و ترجمه مورد بررسي قرار گرفت. بعلاوه اثر دو پپتيد راهنماي KDEL و ZERA در تجمع پروتئين به ترتيب در شبكه آندوپلاسمي و اجسام پروتئيني مورد بررسي قرار گرفت. لاين هاي هموزيگوت بدست آمده در نسل سوم بيان قابل توجه و پايداري از آنتي ژن را در آزمون هاي Real Time PCR و الايزا نشان دادند. بيان پروتئين نوتركيب HA1 در لاين هاي هموزيگوت كاهو با استفاده از آنتي بادي تگ هيستيدين و آنتي بادي اختصاصي HA1 در آزمون هاي اليزا و وسترن بلات، مورد بررسي قرار گرفت. قابليت ايمني زايي HA1 در تحريك توليد آنتي بادي اختصاصي نيز بصورت تزريقي و خوراكي در حيوانات مدل مورد آناليز قرار گرفت. نتايج اليزا نشان داد كه واكسن نوتركيب توليدي مي تواند سيستم ايمني ميزبان را تحريك كند كه اين با مشاهده حضور آنتي بادي هاي اختصاصي در سرم بدست آمده از حيوانات تيمار شده به اثبات رسيد. علاوه بر اين، از آن جا كه يكي از اهداف مهم پژوهش حاضر افزايش سطح بيان ترانسژن در لاين هاي تراريخته از طريق اعمال راهكارهاي مختلف بود، ميزان بيان آنتي ژن در لاين هاي نسل سوم كاهو به شكل كمي اندازه گيري شد. نتايج نشان داد كه سطح بيان ترانسژن در لاين هاي هموزيگوتLLK211 و LLZ121 به ترتيب 344/3 (86/59 ميكروگرم بر گرم وزن تربرگ) و 371/4 (90 ميكروگرم بر گرم وزن تربرگ) درصد كل پروتئين هاي محلول گياه بود. لاين هاي هموزيگوت پايدار نسل سوم كه پروتئين HA1 را در سطح بالايي بيان نمودند اميدبخش توليد اين آنتي ژن ايمني زا در كاهو مي باشند و بذور تراريخته ذخيره شده اين لاين ها را مي توان در آينده در مقياس بالا كشت نمود و گياهان تراريخته حاصل را در جهت توليد آنتي ژن ايمني زا در مواقع ضروري تخليص و استفاده نمود. بنابراين نتايج اين اختراع نشان داد كه با به كارگيري راهكارهاي مناسب مي توان به يك واكسن نوتركيب موثر عليه آنفلوانزاي پرندگان دست يافت. هدف از ارايه اختراع مورد ادعا اين است كه آنتي‌ژن‌هاي مشتق شده از برگ گياه كاهوي ترانس ژنيك، جايگزين مناسبي براي ساير آنتي ژن‌هاي مرسوم است. علاوه بر اين با توليد اين پروتئين نوتركيب به عنوان واكسني با هزينه بسيار كم و بدون هيچ‌گونه عارضه خاص مي‌توان در جهت تقويت و بهبود سيستم ايمني بدن به منظور ايمني درماني فرد بيمار گام مؤثري برداشت.