طراحي وساخت كيت سنجش آپوپتوز

اينوزيتول تري فسفات (IP3) يك پيامبر ثانويه درون سلولي است كه باعث آزاد شدن كلسيم از ذخاير سلول شده و تنظيم كننده بسياري از واكنش هاي داخل سلولي است اختلال در اين مسير منجر به اختلالات متابوليسمي و بدنبال آن بسياري از بيماري ها و ناهنجاري هاي متابوليكي مي شود. اهميت متابوليكي بالاي اين مولكول آن را براي ساخت يك بيوسنسور مناسب مورد توجه قرار مي دهد. يكي از روش هاي بررسي نقش پروتئين ها و تركيبات موجود در سلول استراتژي قطعه قطعه كردن پروتئين هاي گزارشگر Split Reporter Protein Strategy است. براي سنجش مولكول هاي زيستي كوچك با تعبيه كردن دمين هاي حامل جايگاه اتصال مولكول مورد نظر درون ساختار پروتئين هاي گزارشگر مانند لوسيفراز سنسورهاي زيستي ايجاد مي شود بصورتي كه با اتصال مولكول به جايگاه خود پروتئين تغيير ساختار داده و متعاقب آن قطعات جدا شده پروتئين گزارشگر نيز به هم نزديك شده و با كامل شدن ساختار آن پروتئين گزارشگر مجددا فعال مي شود. در روش ارائه شده آنزيم گزارشگر لوسيفر از يك ناحيه خاص بريده شده بطوريكه هر كدام از قطعات ايجاد شده فاقد فعاليت آنزيمي باشند. سپس دو قطعه جدا شده لوسيفراز به دو طرف دمين اتصال يافنده به مولكول IP3 متصل شد. پلاسميد حامل قطعات اتصال يافته به سلول هاي HEK293T منتقل شده و فعاليت سنسور ساخته شده در حضور IP3 و همچنين تركيبات آزاد كننده IP3 مورد بررسي قرار گرفت. نتايج حاصل قابليت بالاي سنسور جهت سنجش ميزان IP3 را تاييد مي كند.

پروتئين t-PA به عنوان يك داروي قلبي براي رفع سكته هاي قلبي مي باشد. براي توليد آن بعد از انتقال ژن انساني به موجودات تراريخت اين پروتئين بايد تخليص شود. چو تخليص آن بايد 100% باشد بنابراين طراحي روش هاي اختصاصي خيلي مهم مي باشد. براي تخليص اين پروتئين ستون هاي ليزين سفارز طراحي شدند كه براساس تمايل بالاي t-PA به ليزين طراحي شده اند. بعد از تثبيت ليزين بر سفارز و بسته بندي محيط حاصله در ستون هاي مناسب مراحل تخليص انجام گرفت. نهايتا با آزمون زيموگرافي نشان داده شد كه ستون ها توانايي تخليص t-PA را داشته اند به گونه اي كه t-PA تخليص شده داراي فعاليت مطلوب بود.

اندازه گيري مقدار فنيل آلانين به طور دقيق ، اختصاصي و فوق حساس به منظور تشخيص بيماري فنيل كتونوري ،در خون نوزادان تازه متولد شده نيازمند ابداع روشهاي نوين مي باشد. و از آنجايكه اساس اندازه گيري مقدار فنيل آلانين در كيتهاي تشخيص طبي ، آنزيم فنيل آلانين دهيدروژناز است. استفاده از روشهاي نوين مهندسي پروتئين بر روي اين آنزيم ميتواند كمك شاياني در راستاي اين هدف كند.ما با تكيه بر اين روشها به توليد يك آنزيم نوتركيب با خصوصيات سنتيكي جديد و اختصاصيت بالا و فوق حساس به فنيل آلانين دست پيدا كرديم.؛ به طوري كه مقدار مصرف اين آنزيم در مقايسه با نمونه خارجي جهت تشخيص بيماري 50 درصد كمتر بوده و اين ميتواند دليلي باشد جهت كاهش هزينه تشخيص بيماري فنيل كتونوريا ؛لازم به ذكر است اين ادعا توسط شركت هاي داخلي كه از نمونه هاي خارجي استفاده ميكردند؛ مورد تاييد قرار گرفته و همچنين اين آنزيم به مرحله تجاري سازي رسيده و باعث صرفه جويي در خروج ارز ميشود.

‏شناسايي آ پوپتوز نقش كليدي در زمينه سازي داروهاي ضد سرطان دارد و در اين طرح يك نانوكاوشگر جديد با استفاده از لوسيفراز رنيلا و آنكسين v ‏ با قابليت تجاري سازي طراحي و ساخته شده است. استفاده از تكنولوژي فيوژن مي تواند تعدادي از مشكلات مربوط به كاوشگرهاي سنتي شامل زمانبر بودن توليد كاوشگر و كاهش سيگنال ناشي از اتصال به ليگاند را حل كند. بعلاوه بر خلاف كاوشگرهاي حاوي فتوپروتئين GFP ‏ استفاده از لوسيفراز در اين نانوكاوشگر مزايايي توليدي و كاربردي فراوان دارد. در حقيقت توليد نانوكاوشگر حاضر به علت توليد كاوشگر به صورت محلول در سلول مزيت اين نوع نانوكاوشگر مي شود. حساسيت اين كاوشگر نيز مزيت منحصر به فرد نانوكاوشگر جديد مي باشد. توليد ارزان قيمت براي مصرف كننده و توليد كننده مزيت فوق العاده محسوب مي شود. بعلاوه به نظر مي رسد طراحي انجام شده حساسيت اين نانوكاوشگر را در مقايسه با ساير كاوشگرهاي موجود به شدت افزيش داده و نانوكاوشگر را به منظور مطالعات تصوير برداري بافتي مناسب تر مي سازد

‏آنتي بادي هاي منوكلونال اهميت تجاري و دارويي فراوان دارند وامروزه به عنوان ابزار مهمي در امر تشخيص و درمان بيماريها در علم پزشكي به كار مي روند. براي مثال اين آنتي بادي ها با هدف گيري دقيق مولكول هدف، موجب تسهيل در تشخيص بيماري هاي خطرناك از جمله سرطان هاي گوناگون شده به عنوان وسيله اي براي هدف گيري و از بين بردن سلول هاي سرطاني و حتي خنثي سازي سم ها در بدن و موارد مشابه ديگر كاربرد گسترده اي دارد. بازده اقتصادي آنتي بادي درماني، بيار چشمگير و قابل توجه است و براي مثال مي توان توليد آنتي بادي را با سودهي يك شركت چند مليتي مقايسه كرد. با توجه به اينكه لوسيفراز شب تاب نيز از ديرباز مورد توجه محققان قرار داشته و كاربردهاي وسيعي به خصوص در زمينه تشخيص بيماريها دارد. اين دو مهم ادغام شده تا بتوان استفاده ي بهتري از آنها در زمينه هاي مختلف داشت. از اين آنتي بادي كه به روش هيبريداسيون توليد شد مي توان در آشكارسازي لوسيفراز در سيستم هاي آشكارسازي نظير الايزاوسترن و نيز در تهيه كيت هاي رنگ آميزي لوسيفراز آنتي بادي براي تشخيص سلولهاي سرطاني استفاده كرد حساسيت اين كيت ها با توجه به افينيتي آنتي بادي توليد شده، بسيار بيشتر بوده و شناسايي سلولهاي سرطاني همان مراحل اوليه را ممكن مي سازد.

آب ميوه ها براي دهه ها تحت آزمون هاي اصالت سنجي شديدي كنترل شده اند اما تقلب در آبميوه ها به خاطر تركيبات شيميايي آن و تغييرات طبيعي وسيع آن به راحتي قابل انجام است. لذا تقلب در توليد آب ميوه يكي از مشكلات جهاني است كه طي 30 سال گذشته تحقيقات زيادي در خصوص شناسايي انواع تقلبات در اين صنعت صورت گرفته شده است. افزودن آب، شكر، اسيدي كننده ها، ميوه هاي ارزان، رنگ ها، طعم دهنده ها و ويتامين ها از موارد معمول تقلب است كه عمده تقلبات در اين صنعت است. گاهي اوقات تا حدي اين تقلبات خبره و پيشرفته است كه تشخيص آن براحتي امكان پذير نخواهد بود. در چنين شرايطي روش هاي اصالت سنجي دقيق، سريع و قابل اعتماد، ابزاري با ارزش و غير قابل جايگزين براي متخصصين جهت راه اندازي سيستم كنترلي براي اطمينان از كيفيت و ايمني آب ميوه وكاهش تقلبات خواهدبود. اين امر منجر به توسعه روش هاي آناليز اصالت سنجي شده است. دي ايزو سيتريك اسيد درميان تركيبات اصالت سنجي و تعيين كيفيت فراورده هاي آب ميوه ها به عنوان يكي از مهمترين فاكتورهاي اصالت سنجي مي باشد. تعيين مقدار اين اسيد در آبميوه ها داراي اهميت زيادي در تعيين اصالت و تشخيص تقلب در صنعت آب ميوه به خصوص آب ليموترش است. اندازه گيري ميزان اسيددي ايزوسيتريك به روش كروماتوگرافي امكان پذير نيست بعلاوه در حال حاضر تنها استاندارد بين المللي موجود براي اين اسيد روشي آنزيمي است در ساخت اين كيت، هدف اجراي روش آنزيمي معتبر بين المللي براي اندازه گيري اسيد دي ايزوسيتريك است. به عنوان روشي ساده، سريع وكم هزينه با به كارگيري دستگاه اسپكتروفتومتر براي اندازه گيري دي ايزو سيترات است. اندازه گيري مقدار دي ايزوسيترات به طور دقيق، اختصاصي و فوق حساس به منظور تشخيص تقلبات صورت گرفته در آبليمو ترش و انواع آبميوه ها نيازمند ابداع روشهاي نوين مي باشد و از آنجايكه اساس اندازه گيري مقدار دي ايزوسيترات در كيتهاي تشخيص انزيمي، آنزيم ايزو سيترات دهيدروژناز است و اين آنزيم نسبت به دي ايزو سيترات حساس ميباشد؛ ما با استفاده از روشهاي نوين مهندسي پروتئين موفق به توليد يك آنزيم نوتركيب با خصوصيات سنتيكي جديد و اختصاصيت بالا به ايزو سيترات شده ايم. پس از توليد آنزيم در يك پروسه چند مرحله اي كه هر كدام از اين مراحل براي اولين بار براي آنزيم ايزو سيترات دهيدروژناز صورت گرفته؛ شرايط آنزيم

سرطان دهانه رحم چهارمين سرطان رايج در بين زنان است. بنابر اعلام سازمان جهاني بهداشت، تنها در سال 2020، 342000 مرگ مرتبط با اين سرطان در سراسر دنيا گزارش شده است. ويروس پاپيلوماي انساني (HPV) به عنوان عامل اصلي بروز اين نوع سرطان شناخته شده است و تقريبا همه ي موارد اين سرطان با يكي از انواع پرخطر اين ويروس آلوده هستند. پاپيلوما ويروس ها DNA ويروس هايي هستند كه مي‌توانند موكوس و پوست گونه‌هاي مختلف جانوران را دچار عفونت كنند. بيش از 200 نوع ژنوتيپ (نوع) ويروس پاپيلوماي انساني (HPV) شناخته شده است كه در 5 جنس آلفا، بتا، گاما، مو و نو قرار مي‌گيرند. همه‌ي انواع پرخطر HPV در جنس آلفا قرار مي‌گيرند كه در اثر تماس جنسي منتقل مي‌شوند و مي‌توانند بيماري‌هاي انساني خطرناك ايجاد كنند. بيشتر عفونت‌هاي HPV پس از 1 الي 2 سال به صورت ايمونولوژيك كنترل مي‌شوند و بيش از 90 % عفونت‌ها پس از 5 الي 7 سال ديگر قابل شناسايي نيستند. اما درصد كمي (حدود 5%) از اين عفونت‌ها مي‌توانند وارد فاز نهفتگي شوند. عفونت‌هاي انواع خطرناك HPVدر صورت ورود به فاز نهفتگي مي‌توانند ضايعات پيش سرطاني و سپس سرطاني ايجاد كنند و موجب يكي از رايج ترين سرطان‌ها در زنان، سرطان دهانه رحم، شوند. به تازگي انجمن سرطان امريكا تشخيص HPV را به عنوان روش پيشنهادي غربالگري سرطان دهانه رحم معرفي كرده است. براي تشخيص HPV، معمولا DNA يا RNA ويروس مورد شناسايي قرار مي گيرد. تست هاي رايج HPV گران اند، نياز به تجهيزات پيچيده دارند و براي استفاده ي آزمايشگاهي طراحي شده اند. در مقابل، وجود يك تست بربالين سريع، كارآمد و ارزان براي تشخيص HPV مي تواند دسترسي افراد را به اين تست افزايش دهد. ما با بهره مندي از فناوري نانو موفق به توليد يك كيت سنجش HPV مبتني بر فرآيند هيبريداسيون DNA با ويژگي هاي نوري و حساسيت بالا شده ايم. ما با استفاده از روش هاي بيوانفورماتيكي ابتدا به طراحي پروب هاي اختصاصي و سنتز آن ها پرداخته ايم و سپس طي چندين مرحله سنتز نانوذرات فلزي و اتصال پروب به آن ها صورت گرفته است و اين طراحي ها و نوع سيگنال خروجي براي اولين بار با هدف تشخيص HPV انجام شده است. در گام بعدي، به منظور بررسي كارايي كيت طراحي شده از نمونه‌هاي پاپ اسمير استفاده شد كه از قبل مثبت يا منفي بودن آن‌ها با يك تست استاندارد مانند PCR بررسي شده