با توجه به اهميت متابوليت¬هاي ثانويه در گياه خرفه در اين تحقيق از روش القاء عصاره مخمر به ريشه¬هاي مويين به عنوان منبع توليد ماده موثره دارويي نورآدرنالين استفاده شد. عصاره مخمر منجر به پايداري ژنتيكي و بيوسنتزي ريشه¬ها و رشد سريع ريشه¬ها ميشود و نيز سيستم مناسبي براي توليد متابوليت¬هاي ثانويه ساخته است. ريشه¬هاي مويين با استفاده از باكتري آگروباكتريوم ريزوژنز سويهAR15834 در ريزنمونه¬هاي بدست آمده از گياهچه¬هاي بذور ايراني خرفه ايجاد شدند. تاييد تراريختي در ريشه¬هاي مويين توسط PCR و با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي ژن rolB بررسي گرديد. ريشه¬هاي مويين بعد از گذشت 28 روز از رشد آنها و رسيدن آنها به رشد مطلوب، مورد تيمار با 5 غلظت صفر، 125، 250، 500، 1000 ميلي¬گرم عصاره مخمر قرار گرفتند. بعد از گذشت 48ساعت از تيمار ريشه¬ها با عصاره مخمر، ريشه¬ها از نظر ميزان توليد نورآدرنالين مورد مقايسه قرار گرفتند. نورآدرنالين در ريشه¬هاي مويين خرفه توسط HPLC اندازه گيري شد. نورآدرنالين در ريشه¬هاي تيمار شده توسط عصاره مخمر سنتز گرديد و ريشه هاي مويين تيمار شده، نورآدرنالين بسيار بيشتري نسبت به ريشه هاي مويين تيمار نشده داشتند. با توجه به قابليت رشد اين ريشه در سطح بزرگ و صنعتي بيوراكتورها از ريشه¬هاي تيمار شده براي استحصال نورآدرنالين و ساير متابوليت¬هاي با ارزش گياه در شرايط كنترل شده آزمايشگاهي مي توان استفاده نمود. همچنين عصاره مخمر منجر به كاهش زمان توليد متابوليت¬هاي مهم گياهي شده است و نيز اين ريشه هاي مويين تيمار شده براي بررسي¬هاي مختلف اثر عصاره مخمر و ديگر محرك ها بر روي مسير متابوليتي و مولكولي بيوسنتز نورآدرنالين و ساير متابوليت¬هاي توليدي درخرفه قابليت استفاده دارند.

استخراج اسيدهاي نوكلئيك خالص و كافي از گياهان آبزي به علت دارا بودن رنج وسيعي از متابوليت¬هاي ثانويه، نحوه اشتباه نمونه¬برداري، خصوصيات مرفولوژيكي آنها، مسافت طولاني محل نمونه¬برداري و آزمايشگاه و... معمولاً مشكل و چالش برانگيز است. از آنجا كه كشورمان ايران يكي از منابع غني از گونه¬هاي بارزش و متنوع آبزي است كه در صنايع مختلف از جمله پزشكي، آرايشي و بهداشتي، داروسازي، غذايي و صنعت داراي كاربرد هستند، توجه دانشمندان و محققين بسياري را به خود جلب كرده¬است. بنابراين استخراج DNA خالص جهت مطالعات مولكولي، شناسايي گونه¬ها، حفظ وارزيابي گونه¬ها، جلوگيري از خطر انقراض گونه¬ها، بررسي پراكنش و توزيع آنها و... از اهميت ويژه¬اي برخوردار است. محققين جهت استخراج اسيدهاي نوكلئيك از گياهان آبزي بايد محلول¬هاي مورد نياز را خود بسازند يا از كيت¬هاي غيراختصاصي موجود كه بسيار گران قيمت هستند استفاده كنند كه در نهايت منجر به استخراجي ناموفق و نامطلوب خواهد شد. بنابراين مشكلات و نيازهاي موجود مارا براين واداشت كه محلولي را توليد كنيم كه نه تنها استخراج آسان و ارزان DNA ژنومي با كيفيت و كميت بالا از نمونه¬هاي گياهان آبزي را فراهم سازد بلكه مي¬توان آن را براي كليه گياهان تازه يا خشك شده¬اي كه داراي متابوليت¬هاي ثانويه بالايي هستند را در شرايط درون و بيرون آزمايشگاهي نيز به كاربرد. در محلول ساخته شده غلظت و PH مواد EDTA ، بتا-مركاپتو اتانول، كلريد سديم، تريس-بيس به خوبي تنظيم و دو ماده موثر PVP و سارگوسيل به بافر استخراجي افزوده شد. با تنظيم مواد موجود در بافر استفاده از ماده پر خطر و پرهزينه نيتروژن مايع جهت خرد كردن نمونه¬ها را حذف نموديم و همچنين استفاده از ماده خطرناك فنول جهت استخراج مطلوب¬تر ضرورتي ندارد. ارزيابي كمي و كيفي اسيدهاي نوكلئيك استخراجي توسط بافر توليدي و مقايسه آن با روش¬هاي متدوال ديگر، خلوص و ميزان بالاي DNA استخراج شده توسط بافر توليدي را نسبت به دو روش ديگر به خوبي نشان دادند، به طوريكه نتايج نشان¬دهنده عاري بودن اسيدهاي نوكلئيك استخراجي از تركيبات پروتييني و پلي¬فنولي/ پلي¬ساكاريدي مي¬باشد. به طوركلي بافر توليدي قابليت كاربرد براي كليه دانشگاه¬ها، آزمايشگاه¬ها و مراكز تحقيقاتي گياهي را دارد كه كاربر با خريد يك محلول 100 ميلي¬ليتري، قادر به جداسازي سريع، ايمن، ارزان DNA با كيفيت و كميت مطلوب از چندين نمونه¬هاي گياهان آبزي و يا حتي غيرآبزي كه داراي تركيبات ثانويه بالا هستند جهت اهداف خود مي¬باشد. قابل ذكر است از آنجا كه اين بافر قادر به جداسازي حتي ميزان بسيار كم DNA موجود در بافت¬هاي خشك شده مي¬باشد، بنابراين از آن مي¬توان براي مظالعات نمونه¬هاي هرباريومي چندين سال قبل نيز استفاده كرد.

يكي از روش هاي اصلي درمان لخته هاي خوني شامل تزريق داخل وريدي فعال كننده هاي پلاسمينوژن(t-PA) به عنوان داروهاي حل كننده لخته خوني است. داروهاي نوتركيبي مثل t-PA نوتركيب (rt-PA) مؤثرترين عامل باز كننده لخته (ترومبوليتيك) است. در اين طرح با استفاده از مهندسي پروتئين يك قطعه از ژن گياهي به يك ژن پروتئاز انساني با استفاده از PCR فيوز شده و پس از كلون سازي به ريشه هاي مويين گياه توتون منتقل شد. پس از تاييد بيان پروتئين نوتركيب شيمري، با استفاده از ستون هاي كروماتوگرافي اختصاصي پروتئين نوتركيب تخليص گرديد. در نهايت فعاليت سنجي پروتئين تخليص شده ارزيابي شد و نتايج نشان داد اين پروتئين قادر به حل كردن لخته هاي خوني به عنوان يك دارو مي¬باشد.

با توجه به اهميت متابوليت هاي ثانويه در گياه شيرين بيان در اين تحقيق از روش القاء ريشه هاي مويين به عنوان منبع توليد ماده موثره دارويي گليسيريزين استفاده شد. رشد سريع پايداري ژنتيكي و بيوسنتزي و زمان كوتاه دو برابر شدن ريشه هاي مويين آنها را سيستم مناسبي براي توليد متابوليت هاي ثانويه ساخته است. ريشه هاي مويين با استفاده از باكتري اگروباكتريوم ريزوژنز سويه AR15834 در ريز نمونه هاي بدست آمده از گياهچه هاي بذور ايراني شيرين بيان ايجاد شدند. تاييد تراريختي در ريشه هاي مويين توسط PCR و با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي ژن rolB بررسي گرديد. سرعت رشد ريشه هاي مويين و ريشه هاي معمولي بعد از دو ماه كشت در شرايط يكسان بررسي گرديد. توليد گليسيريزين در ريشه هاي مويين شيرين بيان توسط HPLC اندازه يگري شد. بر خلاف تحقيقات قبلي در كشت ريشه هاي مويين شيرين بيان توسط HPLC اندازه گيري شد. بر خلاف تحقيقات قبلي در كشت ريشه هاي مويين شيرين بيان در شرايط درون شيشه گليسيريزين سنتز گرديد و ريشه هاي مويين توليد شده سرعت رشد بيشتري نسبت به ريشه هاي معمولي داشتند. با توجه به قابليت رشد اين ريشه در سطح بزرگ و صنعتي بيوراكتورها از ريشه هاي بدست آ»ده براي استحصال گليسيريزين و ساير متابوليت هاي با ارزش گياه در شرايط كنترل شده آزمايشگاهي مي توان استفاده نمود. همچنين اين رشه هاي مويين براي بررسي هاي مختلف مسير متابوليتي و مولكولي بيوسنتز گليسيريزين و ساير متابوليت هاي توليدي در شيرين بيان قابليت استفاده دارند.

گياه شاهبيزك (Atropa belladonna L) از جمله گياهاني است كه به طور وسيع در طب سنتي ايران استفاده مي شود. در اين روش جديد اختراع به منظور كاربرد تكنيك هيدروپونيك براي افزايش توليد متابوليت هاي ثانويه در شاهبيزك ابتدا اين گياهان قبل از اضافه نمودن تووين بيست در شرايط هيدروپونيك كشت شدند. پس از 30 روز از رشد، گياهچه ها به محيط هاي رشد هيدروپونيك محتوي غلظت هاي مختلف از تووين 20 انتقال يافتند. در تيمار تووين 7% بيشترين ميزان آلكالوئيدهاي تروپان (9/29 ميلي گرم در ليتر) در محلول غذايي انتشار يافت در حالي كه كمترين مقدار در تيمار شاهد 0/96 ميلي گرم در ليتر بود. بعد از اعمال تيمارها همه گياهان نمونه پس از شستشوي ريشه آنها با آب شهري توانستند به رشد خود ادامه دهند. براساس نتايج اين روش جديد در اين اختراع ادعا مي شود استفاده از تكنيك هيدرپونيك جهت انتشار متابوليت هاي گياه شاهبيزك در محلول هيدرپونيك نشان دهنده اثر مثبت كاربرد تووين 20 به ميزان 7 درصد است و امكان انتشار مواد فوق در محلول هيدروپونيك مي باشد. خلاصه عنوان اختراع: روش جديد توليد و انتشار مواد آلكالوئيدي گروه تروپان (هيوسيامين، اسكوپولامين و اتروپين) از گياه شاهبيزك در شرايط هيدروپونيك كيفيت گياهان دارويي با ويژگي هاي ژنتيكي ، بيوماس بالا و غلظت متابوليت ثانويه آنها مشخص مي شود. اين تركيبات ثانويه ممكن است با كشت كل گياه يا با استفاده از كشت سلول، بافت و يا اندام ها در بيوراكتور به دست آيد. براي توليد اين متابوليت ها در پروسه مهندسي (كشت بافت و سلول و ...) ميزان توليد بايد حداقل برابر يا حتي بيشتر از مقدار توليد شده توسط گياهان كشت دشه در طبيعت باشد كه از جمله اين روش ها اضافه كردن پيش ماده متابوليت ثانويه به محيط كشت و به گزيني نژادهاي پر محصول كشت هاي سلولي مي باشد. روش جديد هردوپونيك به طور تجاري براي توليد محصولات زيادي مثل سبزيجات و گل ها استفاده مي شوند. طبق نتايج به دست آمده از شرايط درون شيشه اي، پرورش گياهان دارويي در شرايط هيدروپونيك براي توليد و انتشار متابوليت ثانويه به محلول غذايي ممكن است و نتايج به دست آمده از روش جديد اين اختراع معرف اين موضوع است. براي افزايش توليد متابوليت هاي ثانويه در شاهبيزك كه از جمله گياهاني است كه به طور وسيع در طب سنتي ايران استفاده مي شود. ابتدا اين گياهان قبل از اضافه نمودن نووين بيست در شرايط هيدروپونيك كشت شدند. پس از 30 روز ار رشد گياهچه ها به محيط هاي رشد هيدروپونيك محتوي غلظت هاي مختلف از تووين 20 انتقال يافتند. در تيمار تووين 7% بيشترين ميزان آلكالوئيدهاي تروپان 9/29 ميلي گرم در ليتر در محلول غذايي انتشار يافت. در حالي كه كمترين مقدار در تيمار شاهد 0/96 ميلي گرم در ليتر بود. بعد از اعمال تيمارها همه گياهان نمونه پس از شستشوي ريشه آنها با آب شهري توانستند به رشد خود ادامه دهند. براساس نتايج اين روش جديد در اين اختراع ادعا مي شود استفاده از تكنيك هيدروپونيك جهت انتشار متابوليت هاي گياه شاهبيزك در محلول هيدرپونيك نشان دهنده اثر مثبت كاربرد تووين 20 به ميزان 7 درصد است و امكان انتشار مواد فوق در محلول هيدروپونيك مي باشد. با توجه به نتايج اين اختراع ادعا مي شود گياهان كشت شده در شرايط هيدروپونيك ميزان آلكالوئيد بيشتري نسبت به گياهان كشت شده در شرايط خاك دارا هستند. علاوه بر اين در گياهاني كه تحت تاثير تيمار تووين 20 قرار نگرفتند مقدار بيشتري آلكالوئيد تروپان نسبت به گياهان قرار گرفته تحت تاثير تيمار تووين 20، در خود داشتند. اثرات تووين 20 روي انتشار آلكالوئيدهاي تروپان به محلول غذايي خيلي مشهود بوده است. افزايش در مقدار تووين 20 منجر به افزايش آلكالوئيدهاي تروپان در محلول غذايي گرديد. از آنجا كه تووين 20 يك نفوذ پذير كننده است و باعث نفوذپذيري غشاي سلول مي شود، در تيمار 7% تووين 20 نفوذپذيري بيشتري ايجاد گرديد و مقدار بيشتري پيش ماده وارد گياه شده و مسير بيوسنتزي را بيشتر تحريك نمود كه به تبع آن الكالوئيدهاي بيشتري ساخته و مقدار بيشتري از اين آلكالوئيدها به محلول غذايي انتشار يافتند. پيش ماده آلكالوئيدها باعث افزايش مقدار الكالوئيدهاي تروپان گرديد و گياهان تيمار شده با تووين 20 و پيش ماده باعث انتشار مقدار بيشتري از آلكالوئيدهاي تروپان نسبت به گياهان تيمار شده با تووين 20 تنها، به محيط غذايي شد. گياهاني كه تحت تاثير تووين 20 قرار نگرفتند نسبت به گياهان قرار گرفته در برابر اين تيمار مقدار بيشتري آلكالوئيد تروپان دارا بودند. نسبت S/A در شرايط هيدروپونيك بيشتر از شرايط خاك بود. در اين اختراع ادعا مي شود كه متابوليت هاي ثانويه (آلكالوئيدهاي تروپان) گياه شاهبيزك در شرايط هيدروپونيك با استفاده از نفوذپذيري ريشه مي تواند به محيط كشت انتشار يابد. شرايط هيدروپونيك تاثير مثبتي روي توليد آلكالوئيدهاي تروپان دارد و هم چنين پيش ماده روي مقدار و نسبت S/A تاثير قويتري دارد. طبق اين اختراع از اين روش جديد با استفاده از تيمارهاي مختلف پيش ماده هاي مناسب بيوسنتز آلكالوئيدهاي مورد نظر براي ديگر گياهان دارويي استفاده مي شود. ارزش اين روش از آنجا دوچندان مي شود كه در شرايط مزرعه، درون شيشه و بيوراكتور به خاطر وجود بعضي مسائل توليد متابوليت هاي ثانويه دچار مشكل مي شود.

افزايش راندمان توليد نورادرنالين در ريشه هاي مويين گياه خرفه (Purolact oleracea) تحت تاثير ماده متيل جازمونات با توجه به اهميت متابوليت هاي ثانويه در گياه خرفه در اين تحقيق از روش القاء متيل جازمونات به ريشه هاي مويين به عنوان منبع توليد ماده موثره دارويي نوآدرنالين استفاده شد. متيل جازمونات منجر به رشد سريع ريشه ها، پايداري ژنتيكي و بيوسنتزي ريشه ها ميشود و سيستم مناسبي براي توليد متابوليت هاي ثانويه ساخته است. ريشه هاي مويين با استفاده از باكتري آگروباكتريوم ريزوژنز سويه AR15834 در ريزنمونه هاي بدست آمده از گياهچه هاي بذور ايراني خرفه ايجاد شدند. تاييد تراريختي در ريشه هاي مويين توسط PCR و با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي ژن rolB بررسي گرديد. ريشه هاي مويين بعد از ۲۸ روز مورد تيمار با ۴ غلظت صفر، ۵۰، ۱۰۰، ۲۰۰ ميكرومول متيل جازمونات قرار گرفتند و بعد از ۴۸ ساعت از نظر توليد نورآدرنالين مورد مقايسه قرار گرفتند. نورآدرنالين در ريشه هاي مويين خرفه توسط HPLC اندازه گيري شد. نورآدرنالين در ريشه هاي تيمار شده توسط متيل جازمونات سنتز گرديد و ريشه هاي مويين تيمار شده، نورآدرنالين بسيار بيشتري نسبت به ريشه هاي مويين تيمار نشده داشتند. با توجه به قابليت رشد اين ريشه در سطح بزرگ و صنعتي بيوراكتورها از ريشه هاي تيمار شده براي استحصال نورآدرنالين و ساير متابوليت هاي با ارزش گياه در شرايط كنترل شده آزمايشگاهي مي توان استفاده نمود. همچنين متيل جازمونات منجر به كاهش زمان توليد متابوليت هاي مهم گياهي شده است و نيز اين ريشه هاي مويين تيمار شده براي بررسي هاي مختلف اثر متيل جازمونات و ديگر محرك ها بر روي مسير متابوليتي و مولكولي بيوسنتز نورآدرنالين و ساير متابوليت هاي توليدي در خرفه قابليت استفاده دارند.

براي توليد متابوليت هاي ثانويه در طبيعت مشكلاتي مانند سرعت كند توليد متابوليت ها و وابستگي آن به تغييرات فصلي، جغرافيايي و فاكتورهاي محيطي وجود دارد كه اين امر سبب روي آوردن توليد متابوليت ها در شرايط كنترل شده درون شيشه اي شده است در كشت هاي درون شيشه مانند كشت سلولي به دليل عدم تمايز بافت كشت شده در اغلب آنها، مقدار توليد متابوليت ثانويه كم است و برخي از متابوليت ها فقط در بافت هاي كه تمايز مورفولوژيكي را نشان مي دهند تجمع مي يابند. برخي از متابوليت ها نيز فقط در كشت هاي تمايز يافته اي مانند ريشه توليد مي شوند كه كشت ريشه معمولي نياز به فيتوهورموني خارجي داشته و از طرفي سرعت رشد و سنتز متابوليت هاي ثانويه در اين ريشه ها كم است. اخيرا استفاده از اگروباكتريوم ريزوژنز براي ايجاد تمايز، توجه محققين توليد متابوليت هاي ثانويه در كشت سلولي گياهان را به خود جلب نموده است. اين ريشه هاي مويين (ريشه تراريخت) را مي توان در محيط هاي عاري از هورمون هاي گياهي رشد داد و مشاهده كرد كه در مقايسه با سلول هاي مادر، ميزان توليد و تجمع متابوليت هاي ثانويه در آنها افزايش مي يابد. در اين تحقيق با استفاده از باكتري آگروباكتريوم ريزوژنز سويه AR15834 در ريز نمونه هاي بدست آمده از گياهچه هاي زنجبيل شامي ريشه هاي مويين ايجاد شدند. تاييد تراريختي در ريشه هاي مويين توسط PCR و با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي ژن rolB بررسي گرديد. سرعت رشد ريشه هاي مويين و ريشه هاي معمولي بعد از دو ماه كشت در شرايط يكسان بررسي گرديد. ريشه هاي مويين توليد شده ده برابر سرعت رشد بيشتري نسبت به ريشه هاي معمولي داشتند. رشد سريع، پايداري ژنتيكي و بيوسنتزي و زمان كوتاه دو برابر شدن ريشه هاي مويين،آنها را سيستم مناسبي براي توليد متابوليت هاي ثانويه ساخته است. با توجه به قابليت رشد اين ريشه در سطح بزرگ و صنعتي بيوراكتورها از ريشه هاي بدست آمده براي استحصال متابوليت هاي با ارزش گياه مانند اينولين و ... در شرايط كنترل شده آزمايشگاهي مي توان استفاده نمود.

اين اختراع مربوط به ساخت ظروف كشت بافت گياهي با فناوري غوطه ور شدن بافت ها در محيط كشت مايع است. با توجه به اشكالاتي كه سيستم هاي موجود دارا هستند مانند بازده كم و گران بودن قيمت توليد. بنابراين سيستمي ساخته شد متشكل از يك ظرف كشت كه در قسمت زيرين آن محيط كشت قرار مي گيرد و در قسمت مياني ظرف صفحه ايي مخروطي كه قسمت بالاي آن صفحه ايي مشبك براي قرار گيري نمونه است. صفحه مخروطي به گونه‌ايي قرار مي گيرد كه انتهاي قسمت مخروطي درون محيط كشت قرار گيرد، همچنين براي انتقال فشار هواي پمپ در قسمت زيرين لوله¬ايي تعبيه شد كه داراي فيلتر جهت تصفيه هواي ورودي است و بعد از اتصال به پمپ با روشن شدن پمپ فشار هوا به قسمت زيرين وارد مي شود كه اين فشار باعث بالا رفتن محيط كشت و غوطه ور شدن بافت ها مي گردد و بعداز خاموش شدن پمپ محيط كشت به قسمت پايين برمي گردد. سيستم مذكور باعث صرفه جويي در قيمت و همچنين سهولت كاربرد و توانايي اعمال تيمار خشكي كه به اين واسطه اكسيژن رساني به بافت را افزايش مي دهد و همچنين با حذف تكان خوردن بافت، سرعت رشد را نيز افزايش دهد.