عنوان: توليد آنزيم فعال پراكسيداز گياهي در باكتري خلاصه اختراع: آنزيم¬هاي پراكسيداز گياهي يكي از پركاربردترين آنزيم¬ها بوده و در ساختارشان پيوند دي¬سولفيد داشته و براي فولد صحيح و فعاليت به كلسيم و هم (Heme) نياز دارند. تا كنون توليد نوتركيب اين آنزيم¬ها در سيستم پروكاريوتي به صورت اجسام غير¬فعال و نامحلول (اينكلوژن بادي) بوده كه بازيابي پروتئين به فرم محلول و فعال نياز به مراحل ريفولدنگ داشته است. ريفولدينگ علاوه بر هزينه بر بودن، زمانبر مي¬باشد و بخشي از پروتئين نيز طي فرايند از دست مي¬رود. در روش جديد، براي توليد ارزان و سريع پراكسيداز گياهي، از باكتري¬هاي مهندسي شده (مثل Escherichia coli T7 SHuffle) به عنوان ميزبان استفاده شد كه توانايي تشكيل پيوند دي سولفيدي را در سيتوپلاسم خود دارا مي-باشند. با تشكيل پيوندهاي دي¬سولفيدي، ساختار آنزيم به نحوي شكل مي¬گيرد كه با بهينه¬سازي اضافه نمودن كوفاكتورهاي آنزيم از قبيل كلسيم و هم به صورت مستقيم به محيط كشت، اين مواد در داخل باكتري در ساختار پروتئين قرار مي¬گيرند و پروتئين در حال توليد به سمت فرم محلول و فعال هدايت مي¬شود بطوريكه پس از تخليص قابل استفاده مي¬باشد. در اين روش ضمن توليد ارزانتر و سريعتر آنزيم، بازده توليد هم تقريبا دو برابر مي¬شود.

افزايش پايداري و فعاليت آنزيم¬ها در صنعت از اهميت ويژه¬اي برخوردار است. جهت افزايش عملكرد آنزيم¬ها در صنعت از روش¬هايي از قبيل تهيه آنزيم از سوش¬هاي پايدار، تكنيك¬هاي مهندسي پروتيئن و مهندسي محيط استفاده مي¬شود. در اين مطالعه بمنظور افزايش كارايي آنزيم نوتركيب پراكسيداز LDP (ژن آن از گياه Lepidium draba جداسازي و در وكتور بياني pET28a كلون شده بود) در صنعت از مهندسي محيط استفاده شد. LDP از لحاظ توالي اسيد آمينه، ساختار دوم و سوم و همچنين ويژگي¬هاي سينتيكي مي¬تواند به عنوان همولوگ HRP (Horseradish peroxidase) مطرح شده و جايگزيني براي استفاده از آن در صنايع مختلف باشد. HRP از پراكسيدازهاي گياهي كلاس III بوده و در زمينه¬هاي مختلفي از قبيل ساخت بيوسنسور¬ها، كيت¬هاي تشخيص طبي، سنتز مواد آلي، حذف فنول و تركيبات آروماتيك از فاضلاب¬ها مورد استفاده قرار مي¬گيرد. نتايج حاصله از اين تحقيق نشان دهنده آن است كه اضافه شدن اوره (تا به امروز به عنوان يك واسرشته كننده و غير فعال كننده آنزيم¬ها شناخته مي¬شده است) به محيط عملكردي آنزيم باعث افزايش فعاليت آن مي¬شود بطوريكه با افزايش غلظت اوره در محيط فعاليت آن افزايش نشان داد و بيشترين فعاليت آنزيم در حضور اوره 8 مولار مشاهده گرديد. همچنين پايداري دمايي آنزيم در حضور اوره 8 مولار افزايش نشان داد. بر اساس نتايج، در حضوره اوره 8 مولار محدوده pH عملكردي آنزيم تغيير نكرده، ولي فعاليت آنزيم بطور چشمگيري افزايش يافته بود. نتايج نشان داد كه آنزيم در حضور اوره 8 مولار در دماي 25 درجه سانتي¬گراد در مدت زمان 10 روز فعاليت خود را حفظ كرده و حتي تا روز دوم فعاليت آن افزايش يافته است. همچنين در حضور اوره 8 مولار، پارامترهاي سينتيكي آنزيم شامل تمايل آنزيم به سوبسترا و سرعت عملكرد آنزيم تغيير كرد. اين مشاهدات كه براي اولين بار در دنيا گزارش مي¬شود، بيانگر اين است كه با افزايش اوره به محيط واكنش اين آنزيم و در نتيجه افزايش پايداري و فعاليت آن، مي¬توان كارايي اين پراكسيداز را در صنعت افزايش داد.

در اين مطالعه، آنزيم D-لاكتات دهيدروژناز به صورت تك مرحله اي به صورت فعال و محلول توليد شد. براي توليد اين آنزيم ابتدا توالي ژن كد كننده ي آنزيمD –لاكتات دهيدروژناز در بانك ژن پايگاه NCBI با عدد دسترسي(EC 1.1.1.28) يافت شد. سپس بر اساس ترجيح كدوني ميزبان باكتريايي Ecoli سويه ي BL21 با استفاده از نرم افزار Geneious و نيز وب سايت هاي Jcat و IDT تغييرات لازم انجام شد. سپس توالي مورد نظر بعد از طراحي به شركت Biobasic سفارش داده شد. بعد از تحويل گرفتن توالي سنتز شده در داخل وكتورPUC ، مراحل كلونينگ براي انتقال ژن به داخل وكتور بياني pET28a انجام شد. به منظور توليد پروتئين نوتركيب ، باكتري هاي حامل وكتور نوتركيب در محيط كشت TB به مدت 10 ساعت در دماي 18 درجه سانتي گراد با غلظت 1 ميلي مولار IPTG القا شدند. پس از توليد پروتئين و خالص سازي آن با استفاده از ستون كروماتوگرافي ميل تركيبي نيكل-سفارز، به منظور اطمينان از تاخوردگي صحيح و تعيين فعاليت آنزيم نوتركيب توليد شده ، از كاهش جذب NADH در حضور پيروات و آنزيم مذكور در طول موج 340 نانومتر استفاده شد. . نتايج حاصل از فولد صحيح و عملكردي بودن پروتئين نشان مي دهد كه اين پروتئين براي كاربردهاي پزشكي و ساخت بيوسنسورهاي تشخيصي و همچنين استفاده در صنايع گوناگون وابسطه به D-LDH مناسب است. در ضمن در اين مطالعه با استفاده از استراتژي هاي مختلف، موفق به كاهش هزينه تمام شده توليد نوتركيب اين پروتئين شديم كه از نظر اقتصادي بسيار با اهميت است. از جمله استراتژي ها مي توان به مهندسي سويه جهت توليد حداكثري پروتئين و نيز استفاده از ميزبان باكتريايي كه داراي رشد و تكثير سريع و نيز پايين بودن قيمت محيط كشت جهت رشد باكتري اشاره كرد. آنزيم D-LDH نو تركيب توليد شده در اين مطالعه داراي غلظت متوسط 205 ميلي گرم بر ليتر پروتيئن خالص سازي شده مي باشد كه از بالاترين غلظت هايي است كه تاكنون گزارش شده است.