Bacillus anthracis يكي از مهمترين عوامل از نظر اهميت در كاتگوري A قرار گرفته است. از آنجايي كه اين بيماري عفوني كشنده است مي تواند براي استفاده در سلاحهاي زيستي بسيار ايده آل باشد زيرا توليد اين عامل در مقادير عظيم بسيار ساده بوده نيمه عمر طولاني داشته و نيز در محيط پايدار است. اين فاكتورها از مهمترين علل كاربرد اين باكتري در حملات بيوتروريستي و جنگ ميكروبي بوده و مرگ و مير ناشي از آن در موارد درمان نشده 100% مي باشد. در اين اختراع براي هر يك از سكانس هاي اختصاصي (pag,cap) باكتري پرايمر طراحي شد نمونه ها كلون گرديد و سپس با نمونه هاي كنترل منفي ارزيابي شد. سپس پس از انجام واكنش نمونه ها الكتروفورز گرديد كه نمونه براساس وزن هاي نوكلئوتيدي مختلف كه طراحي شده بود از يكديگر تفكيك شد. استاندارد طلايي براي تشخيمص قطعي ارگانيسم مورد بحث تستهاي معمول باكتريولوژيك همانند كشت مي باشد در صورتي كه كشت باكتري مستلزم صرف زمان و هزينه بالايي بوده و نيازمند شرايط امنيت زيستي سطح 4 مي باشد و از سوي ديگر كنترل و مانيتورينگ سياه زخم بخصوص فرم تنفسي بيماري كه به دنبال استنشاق آئروسلهاي عفوني به سرعت منتشر مي شود بسيار حائز اهميت مي باشد. لذا تشخيص سريع قطعي و دقيق بيماري در نمونه هاي باليني بدست آمده از افراد بيمار و يا مشكوك بر پايه تكنيكها و روشهاي تشخيص مولكولي سريع با هدف شناسايي به موقع عامل در مدت زمان كوتاه و عدم نياز به امكانات پيشرفته هدف اصلي مطالعه حاضر قرار گرفته است.

خلاصه توصيف اختراع : ساخت كيت تشخيص مولكولي پي سي آر براي شناسايي ويبرتيو كلرا بر اساس سكانس هاي اختصاصي باكتري وبا بيماري امست كه از طريق آب توسط باكتري وببريو كلرا ايجاد مي شود. اين بيماري در گذشته در ايران به نام مرگامرگي خوانده مي شده است اين باكتري با نوشيدن آب آلوده يا خوردن ماهي نپخته يا خوردن صدف ها وارد بدن مي شود. در ايران بيشترين راه انتقال وبا، سبزي هاي آلوده است. سبزي هايي كه در هنگام كاشته شدن با كود انساني (پساب) تغذيه مي شوند داراي بيشترين آلودگي هستند. وبا در طول تاريخ هفت بار همه گيري جهان گستر داشته است. در قرن نوزدهم چندين بار در اروپا همه گير شد اما امروزه وبا بيشتر در كشورهاي جهان سوم به علت وضعيت ناسالم و غير بربهداشتي آبهاي آشاميدني ديده مي شود. در اين اختراع براي هر يك از سكانس هاي اختصاصي ( CTX B ) باكتري پرايمر طراحي شد نمونه ها كلون گرديد و سپس با نمونه هاي كنترل منفي ارزيابي شد.سپس پس از انجام واكنش نمونه ها الكتروفورز گرديد كه نمونه بر اساس وزن هاي نوكلئوتيدي مختلف كه طراحي شده از يكديگر تفكيك شد. عليرغم موفقيت هاي نسبي بدليل وجود برخي مشكلات علمي و اقتصادي وفرهنگي هنوزدردمهاركامل اين عامل باكتريايي محققين موفق نبوده اند بنابراين يك روش سريع و حساس جهت تشخيص اوليه و كنترل بيماري مورد نياز مي باشد. روشهاي مورد استفاده در آزمايشگاه هاي ميكروبيولوژي جهت شناسايي عامل بيماري وبا بستگي به ويژگيهاي باكتريولوژيك (مورثولوژيك ، بيوشيميايي و ... )استفاد، ميشود. اما همه اين روشها داراي معايب خاص خوداز قبيل صرف زمان ، عدم امكان تشخيص تعداد زياد نمونه در يك زمان محدود وعدم دقت لازم هستند.

خلاصه ساخت كيت تشخيص مولكولي پي سي آر براي شناسايي فراسيسلا تولارمي بر اساس سكانس هاي اختصاصي باكتري تولارمي نوعي بيماري ميكروبي مشترك بين انسان و حيوانات است. كه براساس راه ورود و ميزان ويرولانس عامل بيماري داراي تظاهرات باليني گوناگوني در انسان ميباشد. Francisella tularensis را به عنوان يكي از جنگ افزارهاي بيولوژيك خطرناك تلقي نموده اند زيرا داراي خاصيت عفونت زايي شديد، قابليت انتشار آسان و ظرفيت بالاي ايجاد بيماري و مرگ ميباشد . در اين اختراع براي هر يك از سكانس هاي اختداصي ) tul4 و fopA ( باكتري پرايمر طراحي شد نمونه ها كلون گرديد و هپس با نمونه هاي كنترل منفي ارزيابي شد.سپس پس از انجام واكنش نمونه ها الكتروفورز گرديد كه نمونه بر اساس وزن هاي نوكلئوتيدي مختلف كه طراحي شده بود از يكديگر تفكيك شد. عامل بيماري ،تولارمي بوده وبه مقدار فراوان در حيوانات آلوده يافت شده و از طريق نيش حشرات، تماس مستقيم با بافت آلوده حيوان، استشاق گرد و غبار يا قطرات آلوده، خوردن غذاي آلوده .به عامل بيماري و يا نوشيدن آب آلوده به انسان انتقال مي يابد. تولارمي يك بيماري زئونوز )مشترك بين انسان و حيوان( بوده و بسيار خطرناك مي باشد. مرگ و مير در اين بيماري بسيار بالا بوده و واكسن مناسبي بر عليه آن وجود ندارد. از نظر خطرناك بودن به دليل قابل استفاده بودن به صورت سلاح جنگي در بيوتروريست در كاتگوري A قرار مي گيرد.

در عصر جديد كه استفاده از اينترنت به يك ضرورت تبديل شده ، استفاده از اين ابزار دچار چالش هايي شده كه استفاده از آن را چه در محيط خانه و چه در محيط هاي تجاري و امنيتي با مشكلاتي مواجه ساخته كه كاربران را براي لذت بردن از اين دنياي نوين به روشي ايمن و مطمئن دچار ترس و اضطراب نموده است . همچنين پشتيبان گيري به روش ايمن و سريع در سرورها و يا مسئله تلف شدن زمان جهت حل مشكلات نرم افزاري بوجود آمده در سيستم هاي كامپيوتري از ديگر مشكلات موجود مي باشد . حال ما با توليد اين سيستم همه اين مشكلات را حل نموده و مزاياي ديگري نيز ارائه نموده ايم كه در ادامه آنها را توضيح مي دهيم : \nدلايل نياز به اين دستگاه : \n1) برقراري امنيت و حفاظت مطلق از اطلاعات شخصي و محرمانه براي جلوگيري از دسترسي هكرها در هنگام استفاده از اينترنت و جلوگيري از ويروسي شدن آنها \n2) پشتيبان گيري و بازيابي سريع و ايمن از اطلاعات در كامپيوترهاي شخصي و خصوصا كامپيوترهاي سرور حتي در صورت سوختن فيزيكي هارد ديسك اصلي با ويژگي منحصر به فرد عدم مصرف برق اضافي و عدم فرسودگي هارد پشتيبان در هنگام روشن بودن سرور\n3) بازيابي و آماده به كار شدن سريع دوباره سيستم در صورت بروز هرگونه مشكل نرم افزاري اعم از سيستم عامل و نرم افزارهاي كاربردي به همراه استفاده از نرم افزارهاي ثالث پشتيبان گيري (از جمله نرم افزار Norton gost)\n

بررسي بيوانفورماتيك براي تعيين ناحيه مناسب تشخيص: در اين مرحله با استفاده از بانك هاي اطلاعاتي و نرم افزار هاي مرتبط و همچنين مقالات مرتبط ناحيه مناسب جهت تشخيص تعيين مي گردد و اليگونوكلئوتيد هاي مناسب جهت تشخيص طراحي مي گردد. طراحي انواع كنترل مثبت و كلونينگ ژن هدف : جهت كنترل مثبت استاندارد در اين مرحله ژن هدف مورد نظر بدست امده و وارد وكتور مناسب مي گردد . همچنين كنترل مقبت داخلي با استفاده از روش پرايمر هيبريد سنتز و وارد وكتور مناسب مي گردد. بهينه نمودن واكنش : در اين مرحله واكنش تشخيص مولكولي با استفاده از كنترل مثبت و كنترل مقبت داخلي در رقت هاي مختلف از انواع كنترل ها بهينه مي گردد . بررسي حساسيت و ويژگي كيت: حساسيت: در اين مرحله حساسيت كيت در رقت هاي مختلف انواع كنترل (مثبت و داخلي)تعيين ميگردد . ويژگي : در اين مرحله اين كيت با انواع بيماري هاي رايج در صنعت طيور كشور جهت بررسي ويژگي كيت مورد بررسي قرار مي گيرد. بررسي عملكرد كيت بر روي نمونه هاي باليني : در اين مرحله كيت بر روي نمونه هاي واكسن و همچنين نمونه اي باليني (عفونت طبيعي يا آزمايشگاهي ) و انوع جدايه هاي بانك دانشكده دامپزشكي مورد بررسي قرار مي گيرد.

موضوع اين اختراع طراحي و ساخت كيت تشخيص مقاومت انتي بيوتيكي بتالاكتاماز وسيع الطيف نوع shv، در زمان 30دقيقه الي يك ساعت ، بدون نياز به تجهيزات پيچيده و با حداقل هزينه مي باشد . مقاومت انتي بيوتيكي باكتريها بخصوص بتالاكتاماز نوع shv منجر به نقص روند درماني بسياري از بيماريهاي شايع و خطرناك، اختلال در عمل هاي جراحي ، شيمي درماني و پيوند اعضامي گردد. ميزان مرگ و مير ناشي از مقاومت انتي بيوتيكي در جهان 700000نفر بطور سالانه تخمين زده شده است .تشخيص سريع و دقيق مقاومتهاي انتي بيوتيكي نقش مهمي در انتخاب انتي بيوتيكهاي موثر توسط پزشكان و مديريت بهتر روند عفونت دارد .جهت تشخيص مقاومت انتي بيوتيكي نوع فوق روشهاي مختلفي از جمله: تست تاييدي فنوتيپي ،تست دو ديسكه سينرژيسم ، تست سه بعدي، تست Eوتست PCRوجود دارد. ا ز معايب روشها ي فوق ميتوان به حساسيت پايين ، هزينه بالا و زمانبر بودن اشاره كرد .تكنيك تكثير هم دماي وابسته به حلقه( (LAMPيك روش تشخيصي منحصر به فرد بوده كه در شرايط هم دما و تنها با استفاده از يك انزيم و 4 پرايمر ويژه عمل مي كند .در اختراع فوق از تكنيك lampبراي رديا بي مقاومت نوع shv استفاده گرديد .افزايش سرعت و دقت رديابي مقاومت نوع shv با استفاده از كيت فوق منجر به بهبود مديريت كنترل عفونتها و كاهش اثار زيان بار ناشي از مقاومتهاي انتي بيوتيكي مي گردد (شكل 1).

تب بازگرد ناشي از كنه (TBRF) بيماري حاد عفوني است كه توسط چندين گونه از باكتري بورليا كه ناقلشان كنه هاي نرم از جنس اورنيتودوروس مي باشد، ايجاد مي شود. سير بيماري شامل حملات متناوب تب است كه با فواصل چند روزه بدون تب از هم متمايز مي شوند و عوارضي چون درگير كبد، كليه و دردهاي عضلاني را به همراه دارد. مهمترين عارضه ايجاد شده، عوارض عصبي است كه شامل فلج چشم، مننژيت، فلج نصف بدن، آنسفاليت و درگيري اعصاب نخاعي است. يكي از مشكلات موجود در رابطه با اين بيماري عدم تعيين آلودگي با توجه به علائم باليني است. تب بازگرد ناشي از كنه بيماري است كه به صورت اندميك در ايران وجود دارد، 1415 مورد از سال 1997 تا 2006 در كشور گزارش شده است. بورليا ميكروتي به عنوان عامل مهمي در ايجاد TBRF در ايران و خاورميانه مي باشد. شناسايي گونه بورليا به طور متداول با تزريق انگل به حيوان حساس آزمايشگاهي و بررسي ميكروسكوپي خون حيوان پس از 7-10 روز انجام مي شود كه بسيار ناكارامد و طولاني مدت است و امكان چنين آزمايشي در آزمايشگاه هاي مراكز بهداشتي مناطق بومي و آزمايشگاه هاي تشخيص طبي وجود ندارد. هم چنين با توجه به طولاني بودن زمان آزمايش، عدم ايجاد آلودگي در حيوان آزمايشگاهي در صورت كم بودن ميزان باكتري و موارد منفي اشتباه، امروزه از روش هاي جايگزين به ويژه روش هاي مولكولي PCR استفاده مي شود. يكي از مهم ترين معايب PCR ، پرهزينه بودن آن (نياز به تجهيزات پيشرفته دقيق و عمدتاً گران قيمت) مي باشد. همچنين روش ها و مراحل تشخيص نهايي محصول PCR عمدتاً وقت گير و دشوار مي باشند، به علاوه به دليل توليد مقدار زياد DNA احتمال آلودگي آزمايشگاهي نيز وجود دارد. با توجه به اين كه در كشور ما مطالعات محدودي در مورد بورليا ميكروتي شده است و روش هاي سريع و دقيق و ارزان در تشخيص اين باكتري وجود ندارد و با توجه به اهميت تشخيص و درمان زود هنگام اين باكتري به خصوص در مناطق اندميك براي جلوگيري از شيوع و عوارض جانبي بيماري، ضرورت در ارائه يك روش دقيق و سريع و با هزينه كمتر در كشور وجود دارد. تكنولوژيLAMP روش دقيق و سريع در جهت تشخيص پاتوژن ها حتي در حالت زنده و غير قابل كشت مي باشند كه باعث كنترل سريع عفونت و كاهش عوارض و مرگ و مير ناشي از آن مي شود. تكنولوژيLAMP طي مدت زمان 60 دقيقه قدرت تشخيص دارد، در حاليكه در روش هاي مولكولي ديگر 3-4 ساعت طول مي كشند. در مقايسه با PCR ، تكنولوژيLAMP به تجهيزات ساده تري نياز دارد و با استفاده از يك بلوك حرارتي كه دماي 65 درجه سانتي گراد را فراهم مي كند قابل انجام است. بر خلاف PCR كه نياز به آناليز الكتروفورز دارد، نتايج LAMP با چشم غير مسلح (مشاهده كدورت) قابل مشاهده است. حتي آزمايشگاه ميكروبيولوژي كه تاكنون از روش مولكولي ديگر مثل PCR استفاده نكرده است مي تواند اين روش را براي كاربرد روزمره معرفي كند.

نقشه فني اختراع

سياه‌ زخم ‌يك‌ بيماري‌ حاد عفوني‌ و قابل‌ انتقال‌ بين‌انسان‌ و حيوان مي‌باشد و عامل اين بيماري باكتري باسيلوس آنتراسيس "Bacillus anthracis " مي باشد. مخزن‌ اين‌بيماري‌ در دام‌ (عمدتا گوسفند، بز وگاو) بوده‌ و با مرگ‌ و مير بالا و سريعي‌همراه‌ است‌. انسان‌ به‌ صورت‌ اتفاقي‌ درصورتي‌ كه‌ در معرض‌ تماس‌ با دام‌آلوده‌، پوست‌، پشم‌ و فرآورده‌هاي‌ آن‌قرار گيرد يا از گوشت‌ آلوده‌ استفاده ‌نمايد و يا در هواي‌ آلوده‌ به‌ اسپور تنفس‌ نمايد به‌ بيماري‌ مبتلا مي‌شود. بيماري سياه زخم مي تواند به انسان هايي كه با حيوانات آلوده و يا بافت آلوده حيواني سروكار دارند، سرايت كند. ميكروب اين بيماري مي تواند به عنوان سلاح بيولوژيك مورد سوء استفاده قرار گيرد و توليد آن نسبتاً آسان است، لذا در حال حاضر از اهميت خاصي برخوردار شده است. استاندارد طلايي براي تشخيص قطعي باسيلوس آنتراسيس، تست هاي معمول باكتريولوژيك همانند كشت مي باشد. اما كشت باكتري مستلزم صرف زمان و هزينه بالايي بوده و ويژگي و حساسيت پاييني دارد و همچنين نيازمند شرايط امنيت زيستي سطح 4 مي باشد. از سوي ديگر كنترل و مانيتورينگ سياه زخم بخصوص فرم تنفسي بيماري كه به دنبال استنشاق آئروسل هاي عفوني به سرعت منتشر مي شود، بسيار حائز اهميت مي باشد. لذا تشخيص سريع، قطعي و دقيق بيماري در نمونه هاي باليني بدست آمده از افراد بيمار و يا مشكوك بر پايه تكنيك ها و روش هاي تشخيص مولكولي سريع با هدف شناسايي به موقع عامل در مدت زمان كوتاه و عدم نياز به امكانات پيشرفته ارجحيت دارند. در روش هاي تكثير هدف، تكنيك هاي مهمي همچون واكنش زنجيره اي پليمراز (PCR) وجود دارد. علي¬رغم سادگي و مقدار تكثير بالا، نياز به دستگاه ترموسايكلر بسيار دقيق، كاربرد وسيع اين روش را محدود كرده است. از معايب عمده¬ي اين روش ها نياز به تجهيزات بسيار دقيق و گران قيمت براي تكثير و روش هاي پر زحمت و وقت¬گير براي آشكارسازي محصولات تكثير شده، مي باشند. تكنولوژي LAMP براي تشخيص دقيق و سريع باكتري باسيلوس آنتراسيس عامل بيماري سياه زخم، جهت تشخيص آن بدون نياز به ميكروسكوپ، تست هاي سرولوژيكي و يا استفاده از روش هاي مولكولي گران قيمت مانند PCR، بسيار حائز اهميت مي باشد.

فرانسيسلا تولارنسيس عامل بيماري تولارمي (به عنوان بيماري شبه طاعون جوندگان) معرفي شده است. اين پاتوژن به عنوان يكي از جنگ افزارهاي بيولوژيك خطرناك به شمار مي آيد كه داراي خاصيت عفونت زايي شديد، قابليت انتشار آسان و ظرفيت بالاي ايجاد بيماري و مرگ مي باشد، بنابراين در گروه A عوامل بيوتروريستي قرار دارد. اين باكتري قادر به ايجاد عفونت در انسان از طريق پوست، غشاهاي مخاطي، دستگاه گوارش و ريه ها مي باشد. از آنجا كه تولارمي انساني، بيماري نسبتاً نادري است در صورت مواجه شدن با آن ممكن است بوسيله پزشكان با ظن قوي مطرح نگردد و بدون تشخيص باقي بماند. تكنيك تكثير هم دما به واسطه حلقه (Loop Mediated Isothermal Amplification) يا (LAMP) يك روش تكثيري و مولكولي منحصر به فرد بوده كه در اين روش DNA باكتري مي تواند در شرايط هم دما (يك دما) و تنها با استفاده از يك آنزيم تكثير يابد و به دناتوراسيون DNA الگو (مانند PCR) نيازي نيست. كيت LAMP بر اساس تكنيك قوي و جديد تكثير ژن است كه در حال حاضر ابزار تشخيصي سريع و ساده براي شناسايي عوامل ميكروبي مي باشد. كل اين روش بسيار سريع و آسان مي باشد زيرا عمليات تكثير در كمتر از يك ساعت و تحت شرايط هم دما (65 درجه سانتي گراد) انجام مي گيرد. اين روش به كمك يك مجموعه پنج پرايمر اختصاصي كه شش ناحيه متمايز را در ژن پيدا مي كند و به وسيله انكوبه كردن كل مواد و پرايمر ها در يك لوله عمل مي كند. بررسي محصولات تست به كمك كدورت سنجي تيوب ها مي باشد. براي انجام تست مذكور، از بيمار مشكوك به تولارمي خون گرفته مي شود و خون بايستي بلافاصله در تيوب حاوي ضد انعقاد مثل سيترات و ... ريخته گشته تا لخته نگردد. از نمونه خون مشكوك، استخراج DNA باكتري با استفاده از كيت استخراج DNA صورت مي گيرد و در تكنولوژي LAMP استفاده مي گردد.