ويروس آنفلوانزا متعلق به خانواده ارتوميكسوويريده بوده و شامل سه تيپ A، B وC هست. بيماري آنفلوانزا در انسان بيشتر توسط تيپ A و كمتر به وسيله تيپ B ايجاد مي شود و سالانه تعداد زيادي از افراد در تمامي مناطق جغرافيايي دنيا به آن مبتلا مي شوند. با توجه به اينكه برخي باكتري ها نيز ممكن است علائم مشابه بيماري آنفلوانزا را ايجاد كنند، لذا تشخيص صحيح و سريع بيماري در كاهش مصرف نادرست آنتي بيوتيك ها و مصرف صحيح داروهاي ضدويروسي، بسيار با ارزش مي باشد. يكي از كارآمدترين روش هاي به منظور تشخيص بيماري استفاده از روش هاي مولكولي است. رخداد جهش هاي ژنتيكي در طول زمان، در ژن هاي ويروس آنفلوانزا زياد بوده و اين امر منجر به ناكارآمدي بسياري از پرايمر و پروب هايي تشخيصي ويروس كه در گذشته طراحي شده، گرديده است و همچنين طراحي پرايمر و پروب هاي اختصاصي جديد را نيز مشكل مي نمايد. در سال هاي گذشته مصرف بي رويه دارو هاي ضد ويروسي در طب انساني و واكسيناسيون ناموفق در دامپزشكي، منجر به بروز جهش و مقاومت در برخي از سويه هاي ويروس آنفلوانزا گرديده است. بنابراين در حال حاضر توصيه مي شود، به منظور جلوگيري از بروز جهش هاي ژنتيكي بيشتر، پيش از تجويز دارو و واكسيناسيون، ابتدا ويروس در نمونه هاي باليني با روش هاي مولكولي موجود مانند Real time PCR حتمأ تشخيص داده شود. برخي از مزاياي استفاده از اين روش شامل حساسيت و ويژگي بالا، سرعت بالاي رسيدن به نتيجه ، قابليت اندازه گيري تعداد ماده ژنتيكي ويروس در حجم مشخصي از نمونه آن مي باشد. افزون بر اين، Real-Time PCR مي تواند براي تعداد زيادي نمونه مورد استفاده قرار گيرد. از اين رو طراحي و به كارگيري اين روش به منظور تشخيص دقيق و به موقع در بيماران مشكوك به عفونت آنفلوانزايي و بومي سازي اين فن آوري ضروري است. شناسايي قطعه ژني مناسب بر اساس ژن M ويروس هاي آنفلوانزاي تيپ A به منظور طراحي پرايمر ها و پروب اختصاصي، طراحي پرايمرها و پروب اختصاصي ويروس هاي آنفلوانزاي تيپ A، راه اندازي روش rt-Real-Time PCR به منظور شناسايي ويروس در نمونه هاي باليني، تعيين حساسيت و ويژگي باليني و آزمايشگاهي تست طراحي شده از اهداف بدست آمده در اين روش نوين تشخيص باليني مي باشد. از مزاياي اين اختراع مي توان شناسايي ويروس آنفلوانزاي تيپ A در نمونه هاي باليني با حساسيت و ويژگي بالا به صورت كمي و كيفي و بومي سازي آن، هموارشدن ساخت انواع كيت هاي تشخيصي Real-Time PCR آنفلوانزا در كشور بصورت توليد انبوه و صرفه جويي ارزي قابل توجه، شناسايي دقيق و سريع بيماري آنفلوانزا در زمان پاندمي هاي احتمالي در داخل كشور را بر شمرد.

ويروس آنفلوانزا متعلق به خانواده ارتوميكسوويريده بوده و شامل سه تيپ A، B وC هست. ويروس هاي آنفلوانزا پرندگان يكي از دلايل اصلي ايجاد تلفات بالا و خسارات اقتصادي در صنعت طيور هستند. علاوه بر آن، آنفلوانزاي پرندگان و سويه هاي جديد آن توانايي ايجاد پاندمي هاي مشابه آنچه در اسپانيا در 1918 و هنگ كنگ در 1968 روي داد، را دارند. تحقيقات در مورد شناسايي ساختار، روش هاي كارآمد و سريع جهت تشخيص، كنترل و پيشگيري در مورد ويروس آنفلوانزا از سال 1918 به بعد شدت يافت و مطالعات زيادي در جهت توليد واكسن هاي كشته و نوتركيب ويروس، بر روي گليكو پروتئين هاي سطحي HA و NA انجام شد، كه تاكنون نيز ادامه دارد. هدف از انجام پژوهش حاضر طراحي پرايمرهاي اختصاصي ناحيه Cleavage site مولكول هماگلوتينين ويروس آنفلوانزاي پرندگان A/chicken/Iran/772/1998(H9N2) ، كلونينگ ناحيه مورد نظر در وكتورهاي بياني و توليد آنتي ژن نوتركيب هماگلوتينين از اهداف به دست آمده در اين پژوهش مي باشد. براي اين منظور ابتدا ويروس آنفلوانزاي پرندگان تحت تيپ H9N2 با مشخصه A/Chicken/Iran/ 772/1998(H9N2) در مايع آلانتوئيك تخم مرغ جنين دار تكثير و RNA ويروس جداسازي شد. سپس بر اساس اطلاعات موجود در بانك داده ها (NCBI) با استفاده از توالي ژن هماگلوتنين پرايمر هاي اختصاصي طراحي شد. ناحيه ژني مورد نظر تكثير و در پلاسميد PTZ57R كلون و در باكتري E. coli GM2163 ترانسفورم و توالي يابي گرديد. سپس از كلون هاي تائيد شده پلاسميد جدا سازي و با آنزيم هاي محدود كننده برش داده شد. قطعات بريده شده با آنزيم هاي محدود كننده خالص سازي گرديد و به وكتورهاي بياني گروه PET و باكتري E. coli BL21(DE3) انتقال يافت. وجود قطعه ژني Insert در پلاسميد به روش PCR با پرايمرهاي T7 و توالي يابي تأييد گرديد. القا بيان ژن ناحيه Cleavage site از مولكول هماگلوتنين در باكتري هاي E .coli BL21(DE3) با استفاده از IPTG انجام شد و وجود پروتئين مورد نظر و سايز آن با استفاده از الكتروفورز SDS –PAGE و وسترن بلاتينگ تأييد گرديد. از مزاياي توليد اين آنتي ژن نوتركيب مي توان به هموار شدن مسير براي توليد صنعتي كيت هاي تشخيصي ويروس آنفلوانزاي پرندگان با حساسيت و اختصاصيت بالا در كشور و بومي سازي اين صنعت اشاره كرد. از سوي ديگر مي توان با بهره گيري از اين آنتي ژن اقدام به طراحي واكسن هاي نوتركيب آنفلوانزا در آينده نمود. ضمنا مزيت اختراع فوق نسبت به ساير روش¬هاي پيشين به شرح زير مي باشد: 1- توليد آنتي ژن اختصاصي نوتركيب هماگلوتنين ويروس آنفلوانزاي پرندگان با استفاده از سوش بومي كشور 2- بومي سازي توليد آنتي ژن نوتركيب هماگلوتينين ويروس آنفلوانزاي پرندگان در كشور و توليد انبوه آن 3- هموار شدن ساخت انواع كيت هاي تشخيص آنفلونزاي پرندگان با استفاده از آنتي ژن نوتركيب ساخته شده 4- با توليد آنتي ژن مذكور بستر لازم براي شروع تحقيقات جديد در زمينه توليد واكسن نوتركيب و كيت هاي تشخيص دقيق و حساس براي بيماري آنفلوانزاي پرندگان مهيا مي گردد. 5- با بهره گيري از اين آنتي ژن و ساخت كيت تشخيصي با دقت بالا، ميتوان ضمن صرفه جويي قابل توجه در زمان، هزينه تشخيص بيماري آنفلوانزاي پرندگان را بسيار كاهش داد.

يكي از مهمترين اعضاي خانواده ارتوميكسوويريده ويروس آنفلوانزا بوده و شامل سه تيپ A، B وC مي باشد. هر سه تيپ ويروس توانايي ايجاد بيماري آنفلوانزا در انسان را دارند. تيپ B ويروس آنفلوانزا، يكي از مهمترين عوامل ايجاد كننده اپيدمي هاي آنفلوانزايي در جوامع مختلف انساني بوده و علاوه بر واگيري بالا حتي در مواردي مي تواند منجر به مرگ بيماران گردد. با وجود خطر بالقوه ويروس آنفلوانزا تيپ B در ايجاد پاندمي و عفونت، در حال حاضر درمان هاي ضد ويروسي مؤثري موجود مي باشد. به منظور بيشترين كارايي، اين داروها بايد در 36 تا 48 ساعت بعد از شروع علائم در بيمار تجويز شوند. اين در حالي است كه بسياري از روش هاي قديمي قادر به شناسايي عفونت در اين محدوده زماني نيستند. بنابراين راه اندازي و ساخت تست هاي دقيق و سريع مانند rt-Real time PCR براي تشخيص به موقع بيماري ضروري است. از سوي ديگر، با توجه به شباهت بيماري هاي ناشي از عفونت برخي باكتري ها و ويروس ها مانند آدنو ويروس ها، رينوويروس ها و آنفلوانزاهاي تيپ A با بيماري ناشي از عفونت ويروس آنفلوانزاي تيپ B، تشخيص صحيح و سريع بيماري در كاهش مصرف نادرست آنتي بيوتيك ها و مصرف صحيح داروهاي ضدويروسي، بسيار با ارزش مي باشد. يكي از مهمترين مشكلات بر سر راه گسترش روش Real-Time PCR به منظور تشخيص ويروس آنفلوانزاي تيپ B، فراواني زياد جهش هاي ژنتيكي در ژن هاي ويروس آنفلوانزا در طول زمان بوده كه اين امر نه تنها منجر به ناكارآمدي بسياري از پرايمر و پروب هايي تشخيصي ويروس كه در گذشته طراحي شده، گرديده، بلكه طراحي پرايمر و پروب هاي اختصاصي جديد را نيز با مشكل روبرو مي سازد. حساسيت و ويژگي بالا، سرعت بالاي رسيدن به نتيجه، قابليت اندازه گيري تعداد ماده ژنتيكي ويروس در حجم مشخصي از نمونه و امكان ارزيابي همزمان تعداد زيادي نمونه ار مهمترين مزاياي اين روش مي باشد. بنابراين طراحي و به كارگيري اين روش به منظور تشخيص دقيق و به موقع در بيماران مشكوك به عفونت آنفلوانزايي و بومي سازي اين فن آوري ضروري است. ابداع و بومي سازي روش نوين Real-Time PCRيك مرحله اي به منظور شناسايي كمي ويروس آنفلوانزاي تيپ B در نمونه هاي باليني و آزمايشگاهي، حساسيت و ويژگي بالاي اين روش در تشخيص ويروس، صرفه جويي ارزي قابل توجه و هموارشدن ساخت انواع كيت هاي تشخيصي Real-Time PCR يك مرحله اي آنفلوانزا در كشور بصورت توليد انبوه و امكان تشخيص دقيق و سريع بيماري آنفلوانزاي تيپ B در زمان پاندمي هاي احتمالي در داخل كشور، از جمله مهمترين اهداف و كاربرد هاي بدست آمده در اين سيستم تشخيصي باليني مي باشد.