سيستم ويرايش ژنوم با تكنيك CRISPR تاكنون موفقيت آميزترين سيستم ويرايش ژنوم در دنيا مي باشد. مهمترين مرحله در اين سيستم، انجام كلونينگ موفقيت آميز gRNA در وكتورهاي كريسپري است.كيت هاي موجود در بازار با پرداخت ارز زيادي وارد كشور مي شوند. به علاوه، روش هاي ذكر شده در منابع جهت انجام فرايند كلونينگ gRNA،كم بازده و با اتلاف زمان همراه مي باشند. علاقه وافر محققان كشور براي استفاده از اين سيستم ويرايش ژني ما را بر آن داشت تا با طراحي كيت كلونينگ gRNA سيستم كريسپر بدون تاثير پذيري بالا از تحريم ها، دركشور توليد شود. كيت حاضر شامل وكتورهاي CRISPR ، سلولهاي مستعد، آنزيم T4 DNA Ligase، بافر اتصالي يا آنيلينگ پرايمرها، بافر رقيق كننده ، وكتور PUC19 بعنوان كنترل مثبت، محيط كشت و پروتوكل كارآمد براي كلونينگgRNA در وكتورهاي CRISPR مي باشد، كه به محققين اين امكان را مي دهد تا به منظور ويرايش ژنومي، در ساده ترين شرايط، فرايند كلونينگ را با بالاترين بازده انجام دهند. از كاربردهاي اين كيت ميتوان به دستكاري ژنتيكي در هر قسمت DNA به منظور ايجاد مدل هاي حيواني و رده هاي سلولي بيماري و همچنين اصلاح ژنتيكي در مدل هاي بيماري آزمايشگاهي نام برد.

كلون‌سازي ژن به معناي جدا كردن توالي مشخص از ژنوم يك موجود و قرار دادن آن در ژنوم موجود ديگر با هدف ايجاد نسخه‌هاي متعدد از يك ژن منفرد است. كلونينگ داراي كاربردهاي وسيعي در حوزه‌ي مختلف زيستي است. كيت‌هاي كلونينگ موجود در بازار معايبي دارند از قبيل: هزينه بالا ناشي از وجود نوعي آنزيم خاص يا مستر ويژه با تركيب نامشخص و انحصاري، نياز به استفاده از آنزيم برشگر، نياز به طراحي چندين نوع پرايمر و عدم وجود يا مناسب نبودن نوع وكتور استفاده شده در كيت‌ها. لذا اين نواقص ما را بر آن داشت تا با طراحي كيت كلونينگ Multiplex بر پايه روش overlap extension PCR تمام كمبودهاي موجود در ديگر كيت‌ها جبران شود. دراين كيت براي اولين بار در دنيا بدون استفاده از آنزيم خاص يا مستر ويژه ساخت وكتور نوتركيب توسط يك جفت پرايمر يونيوسال و آنزيم ليگاز انجام مي‌شود. همچنين وكتور استفاده شده در اين كيت بگونه ‌اي مورد دستورزي قرار گرفته است كه مناسب براي انتقال و بيان در سلول‌هاي پستانداران باشد. كيت مذكور شامل جفت پرايمر يونيورسال، وكتور خطي PCDNA3، جفت پرايمر وكتورPCDNA3، وكتور حلقوي PUC19، سلول‌هاي مستعد، محيط كشت مايع غني، محلول آنيلينگ و پروتكل كارآمد مي‌باشد.

استراتژي هاي كلونينگ رايجي كه چندين دهه در حال استفاده هستند شامل استفاده از آنزيم هاي برشگر نوع II براي توليد قطعات DNA مناسب، تغييرات انتهاهاي DNA به منظور ايجاد انتهاهاي صاف و يا چسبنده و ligate كردن قطعات DNA براي توليد پلاسميد يا ساير انواع وكتورهاي بياني نوتركيب مي باشد. اما اين روش¬ ها معايب بسياري دارد. اين روش ها وابسته به هضم آنزيمي توالي اينسرت و وكتور بياني مورد نظر با استفاده از دو آنزيم برشگر متفاوت مي باشد. بنابراين، در صورتي كه جايگاه برش آنزيمي آنزيم برشگر در توالي اينسرت وجود داشته باشد با محدوديت مواجه خواهيم شد. ثانيا، كارايي پايين هضم آنزيمي انتهاهاي محصولات PCR بوسيله آنزيم هاي برشگر اغلب منجر به ناكامي در روش هاي ساخت پلاسميد مي شود. تمامي اين مشكلات نتيجه نيازمندي به هضم آنزيمي براي توليد انتهاهاي چسبنده در توالي اينسرت و همچنين وكتور بياني مورد نظر مي باشد. علاوه براين، تمامي آنزيم هاي برشگر مورد استفاده جهت انجام فرايند كلونينگ در كشور ما وارداتي بوده و به وسيله ي شركت هاي بزرگ اروپايي و آمريكايي ساخته و عرضه مي شوند كه اين امر منجر به خروج ميزان زيادي ارز از كشور مي شود. با توجه به محدوديت هاي ذكر شده، در اختراع حاضر ما بر آن شديم تا نسل جديدي از كلونينگ پيشساز ميكروآرنا بدون نياز به استفاده از آنزيم هاي برشگر را ارائه نماييم و در نهايت يك كيت بومي كلونينگ پيشساز ميكروآرنا را به محققين كشورمان عرضه نماييم. در استراتژي ارائه شده در واقع با مهندسي توالي هاي موجود در يك وكتور بياني و طراحي دو مجموعه پرايمر هوشمند براي واكنش هاي PCR مربوط به توليد توالي پيشساز Pre-microRNA مورد نظر ما توانستيم توالي اينسرت (pre-microRNA) با جايگاه هاي برش متناسب با وكتور بياني را بدون نياز به آنزيم برشگر توليد نماييم. با استفاده از اين روش محققين مي توانند هر نوع توالي پيشساز مربوط به هر ميكروآرنايي را بدون نياز به استفاده از آنزيم هاي برشگر در داخل وكتور بياني موجود در كيت كلون نمايند. اختراع حاضر با ارائه پروتكل باكارايي بالا يك روش سريع،راحت ، بسيار ارزان و مطمئن در زمينه ي كلونينگ پيشساز ميكروآرنا مي باشد.

كنترل استاندارد وزن مولكولي DNA، به طور معمول همراه با نمونههايDNA ، در آزمايشگاههاي زيست شناسي مولكولي بر روي ژل قرار ميگيرد و الكتروفورز ميشود تا به عنوان مرجع وزن مولكولي DNA عمل كند. هضم آنزيمي DNA ژنومي، پلاسميد و تكثير با روش PCR از جمله اصلي‌ترين گزينه‌ها براي توليد انواع ماركرهاي تجاري مختلف محسوب ميشوند، كه هر كدام داراي معايب بسياري هستند. در اين اختراع ما يك روش جديدي براي ساخت پلاسميد توليد كننده ماركر DNA معرفي نموده‌ايم، كه شامل تكثير قطعات DNA داراي تواليهاي همپوشان توسط PCR و اتصال اين قطعات به يكديگر براي ايجاد وكتور نوتركيب است. در اين روش، براي ساخت قطعات با وزن‌هاي متفاوت از پرايمرهاي داراي جايگاه آنزيم‌هايEcoR1 و Bbs1 استفاده شد كه بعد از تيمار توسط آنزيمBbs1 و ساخت وكتور نوتركيب، تنها با يك واكنش برش توسط آنزيم EcoR1 ماركر DNA ايجاد ميشود. به منظور يكسان سازي غلظت‌هاي هر يك از باندها تعداد متفاوتي از هر يك از قطعات درون وكتور قرار داده شد. از اين نشانگر وزن مولكولي DNA، ميتوان براي اندازگيري دقيق سايز باندهايDNA ، با طول 100 تا 3000 جفت باز، كه يك محدوده‌ي مناسب براي بسياري از قطعات در طول الكتروفورز است، استفاده كرد. كنترل استاندارد وزن مولكولي DNA، به طور معمول همراه با نمونههايDNA ، در آزمايشگاههاي زيست شناسي مولكولي بر روي ژل قرار ميگيرد و الكتروفورز ميشود تا به عنوان مرجع وزن مولكولي DNA عمل كند. هضم آنزيمي DNA ژنومي، پلاسميد و تكثير با روش PCR از جمله اصلي‌ترين گزينه‌ها براي توليد انواع ماركرهاي تجاري مختلف محسوب ميشوند، كه هر كدام داراي معايب بسياري هستند. در اين اختراع ما يك روش جديدي براي ساخت پلاسميد توليد كننده ماركر DNA معرفي نموده‌ايم، كه شامل تكثير قطعات DNA داراي تواليهاي همپوشان توسط PCR و اتصال اين قطعات به يكديگر براي ايجاد وكتور نوتركيب است. در اين روش، براي ساخت قطعات با وزن‌هاي متفاوت از پرايمرهاي داراي جايگاه آنزيم‌هايEcoR1 و Bbs1 استفاده شد كه بعد از تيمار توسط آنزيمBbs1 و ساخت وكتور نوتركيب، تنها با يك واكنش برش توسط آنزيم EcoR1 ماركر DNA ايجاد ميشود. به منظور يكسان سازي غلظت‌هاي هر يك از باندها تعداد متفاوتي از هر يك از قطعات درون وكتور قرار داده شد. از اين نشانگر وزن مولكولي DNA، ميتوان براي اندازگيري دقيق سايز Making plasmid producing DNA marker

تشخيص RNA نقش مهمي در زمينه‌هاي مختلفي از جمله پزشكي، كشاورزي و زيست‌فناوري دارد. روش‌هاي سنتي تشخيص RNA مانند PCR و Northern blot محدوديت‌هايي از جمله زمان‌بر بودن و عدم اختصاصيت دارند. با توجه به نياز به يك روش سريع، ساده و اختصاصي براي تشخيص RNA ، يك حسگر RNA كه از سيستم ويرايش ژن CRISPR-Cas9 و مكانيسم جابجايي رشته‌ها براي تشخيص RNAهاي خاص استفاده مي‌كند، ارائه شده است. اين حسگر مي‌تواند در آزمايشگاه (In-vitro) و داخل سلول (In-cyto) براي كاربردهاي مختلفي از جمله تشخيص بيماري، بررسي بيان ژن و ويرايش ژنوم استفاده شود. اين پلتفرم، بر اساس دو مولفه اصلي، سيستم ويرايش ژن CRISPR-Cas9 و مكانيسم جابجايي رشته‌ها با استفاده از دو جايگاه Toe-Hold، عمل مي‌كند. واكنش اين حسگر با يك رشته RNA راه انداز (Trigger RNA) ، باعث فعال شدن سيستم CRISPR-Cas9 مي‌شود. اين فرايند خود منجر به برش DNA هدف ميشود كه در سطح آزمايشگاهي قابل مشاهده بر روي ژل آگارز است. باتوجه به اختصاصيت آن، ميتواند براي تشخيص زودهنگام بيماري، پايش و تشخيص عفونت هاي ويروسي كاربرد داشته باشد. اين پلتفرم يك روش نوآورانه براي تشخيص RNA ارائه مي‌دهد كه با ادامه توسعه، در آينده به ابزاري ارزشمند براي تشخيص، درمان و تحقيقات تبديل شود.