BMP ها پروتئين هايي با خاصيت تحريك استخوان زايي هستند كه براي درمان شكستگي هاي حاد بكار مي روند. عليرغم مزاياي زياد، تجويز دوز بالايي از اين پروتئين هاي نوتركيب براي بدست آمدن نتايج كلينيكي مطلوب لازم است كه اين مسئله به نوبه خود باعث بروز عوارض جانبي و هزينه هاي سنگين درمان مي شود. استراتژيهاي متفاوتي براي توليد نسل دوم BMP ها با كارايي بيشتر و عوارض جانبي كمتر بكار برده شده اند، مثلا دستكاري ژنتيكي و تغيير ناحيه اتصال به هپارين، به منظور افزايش زمان ابقاء (local retention time) مورفوژن در محل اثر، يكي از اين روش ها محسوب مي شود. به منظور بهبود خواص BMP-7، موتانت جديدي از اين پروتئين با موفقيت در ميزبان يوكاريوتي (CHO) بيان گرديد. جايگزيني پايانه آميني BMP-7 با ناحيه اتصال به هپارين از BMP-2، به منظور افزايش ظرفيت اتصال به تركيبات ماتريكس خارج سلولي از جمله هپارين و هپاران سولفات صورت گرفت. موتانت جديد علاوه بر داشتن فعاليت بيولوژيكي، قابليت اتصال به هپارين بيشتري نسبت به نوع تجاري از خود نشان داد. به نظر مي رسد اين پروتئين با ناحيه اتصال به هپارين تقويت شده به عنوان اولين داروي نسل دوم مزيت هاي كلينيكي بيشتري نسبت به فرم تجاري موجود ارائه دهد .

در حال حاضر از پركاربردترين پروتئينهاي نوتركيب درماني موجود، آنتي بادي هاي منوكلونال (mAb) هستند. امروزه اكثر آنتي بادي ها در سلول هاي پستانداران به ويژه سلول هاي تخمدان هامستر چيني(CHO) توليد مي شوند. يكي از موانع براي توليد آنتي بادي ها در سلول هاي CHO، بيان پايين اين سلول ها مي باشد. نياز روز افزون به اين آنتي بادي هاي درماني، منجر به توسعه فرايندهاي توليد در مقياس بالا، بهبود ميزان توليد و بهينه سازي سيستم بيوراكتور شده است. قبل از كشت در بيوراكتور، مراحل اوليه توليد از اهميت خاصي برخوردار هستند كه از طريق دست ورزي اين مراحل مي توان به افزايش توليد دست يافت. از طريق مهندسي وكتور با افزايش فعاليت رونويسي، ميزان توليد آنتي بادي در محيط كشت سلول را مي توان افزايش داد. انتخاب يك پرموتور قوي مي تواند در افزايش بيان پروتئين هدف موثر باشد. پرموتور ژن فاكتور طويل سازي (EF-1α) در هامستر چيني ( (CHEF-1α به دليل سيستم بياني همولوگ، مي تواند كانديد مناسبي براي ساخت سلول پايدار باشد كه در اين مطالعه وكتورحاوي پرموتورCHEF-1α به منظور افزايش بيان آنتي بادي ساخته شد. چالش ديگري كه در رابطه با بيان آنتي بادي هاي هدف وجود دارد، بيان مناسب و متعادل از هر دو زنجيره آنتي بادي مي باشد. به صورت متداول بيان آنتي بادي در سلول هاي CHO از طريق ترانسفكت سلول ها با دو پلاسميد مختلف كه هر كدام يك زنجيره را بيان مي كنند، صورت مي گيرد. ترانسفكشن سلول با دو وكتور مستقل، مؤثرترين روش براي بيان متعادل هر دو رشته نيست. به طور عمومي پذيرفته شده است كه محل دخول سازه در ژنوم تأثير بسزايي در بيان ژن نوتركيب دارد. وجود دو زنجيره بر روي يك وكتور مي تواند منجر به بيان متعادل و متناظر هر دو زنجيره در سلول شود. با قرار دادن يك توالي اتصالي بين هر دو زنجيره آنتي بادي، مي توان بيان هر دو رشته را تحت كنترل يك پرموتور قرار داد. در اين مطالعه از توالي اوليگو پپتيدي 2A با منشاء ويروسي استفاده شده است. اين توالي طولي با ميانگين 18 تا 22 اسيد آمينه دارند. زنجيره هاي سبك و سنگين به طور همزمان از روي يك mRNA با يك Open Reading Frame (ORF) بيان مي شوند. در مرحله سنتز پروتئين، توالي پپتيدي 2A طي فرايند Ribosome Skipping سبب سنتز مجزاي هر يك از رشته ها مي شود. در اين اختراع، طراحي و ساخت وكتور حاوي پرموتورCHEF-1α و هر دو زنجيره آنتي بادي كه با توالي اوليگو پپتيدي 2A به يكديگر متصل شده اند، و همچنين استفاده از اين وكتور بياني براي بيان آنتي بادي هدف در رده سلولي CHOمورد بررسي قرار مي گيرد.

زمينه فني اختراع اين اختراع مربوط مي شود به خالص سازي با روش هاي منحصر به فرد پروتئين مورد نظر و فرمولاسيون و در نهايت، بررسي خصوصيات فارماكوكينتيكي مولكول جديد دارويي mt-PA در حيوان آزمايشگاهي Rat شرح مختصر در حال حاضر بيماري هاي قلبي – عروقي كه به وسيله اختلالات قلبي و عروق خوني ايجاد مي‌شود، ساليانه 3/17 ميليون مرگ و مير را به خود اختصاص ‌داده اند و آمارها بيانگر رشد بيشتر از 6/23 ميليون در سال 2030 مي‌باشند. تا به حال 3 داروي ترومبوليتيك مورد تاييد FDA قرار گرفته است كه هر كدام مشكلاتي مربوط به نيمه عمر كوتاه و ميل اتصالي پايين به ترومبين و تخليه فيبرينوژن گردش خون و ... دارد. با توجه به خصوصيات مطلوب مولكول جديد دارويي mt-PA از جمله، كاهش پاكسازي پلاسمايي، كاهش اندازه مولكول و افزايش نيمه عمر در جريان خون، افزايش اختصاصيت به فيبرين و مقاومت به مهار-كننده پلاسمينوژن بافتي (PAI-1)، در اين اختراع خالص سازي با استفاده از روش هاي افينيتي كروماتوگرافي با تركيب بافرهاي منحصر به فرد براي اين پروتئين و Size exclusion chromatography و نيز فرمولاسيون اين مولكول انجام شد و در نهايت، خصوصيات مطلوب فارماكوكينتيك آن در مقايسه با داروي مشابه موجود در بازار در حيوان آزمايشگاهي rat نشان داده شد.

نظر به نقش حياتي عوامل ترميوبيتيك در درمان بيماران با انفاكتوس حاد قلبي، توسعه انواع عوامل ترميوبيتيك بسيار مورد توجه بوده است. امروز داروهاي فعال كننده پلاسمينوژن جديد با ويژگيهاي بهينه فرماكوكينتيك و فارماكوديناميك مدنظرند. فرم هاي متفاوت كوتاه شده ()Truncated) شامل دويمنهاي K2S با هدف كاهش حذف كبدي و افزايش نيمه عمر دارو مورد بررسي قرار گرفته اند ليكن با حدف دومين finger كه نقش اتصال به فيبرين را دارد تمايل دارو به فيبرين كاهش و نتيجتاً عارضه هموراژي آن افزايش مي يابد. در اين مطالعه به جهت جبران اين نقص دارو يك قطعه 4 آمينو اسيدي (GHRP) با تمايل مناسب به فيبرين در بالادست دومينهاي K2S قرار گرفته كه منجر به بهسازي تمايل به فيبرين و كاهش عوارض جانبي دارو مي گردد. همچنين يك قطعه 4 آمينو اسيدي واقع در توالي KHRR 296-299 با چهار آمينو اسيد آلانين جايگزين گرديده كه اين عمل در افزايش مقاومت به مهاركننده دارو و افزايش نيمه عمر آن مؤثر است.

بيماري ترومبوآمبولي يكي از بيماريهاي شايع عروق خوني در انسان مي باشد كه عروق ارگانهاي مختلف به ويژه عروق كرونر قلب، عروق مغزي، عروق ريه و وريد‎هاي عمقي اندام‎ها به ويژه اندام تحتاني را درگير مي نمايد . سكته مغزي كه يكي از اصلي ترين نتيجه اين اختلالات بوده سومين دليل اصلي مرگ و مير در دنيا مي باشد. كشف فعال كننده هاي پلاسمينوژن كه مي توانند به صورت آنزيمي لخته خوني را حل كنند (فيبرينوليز) و جان بيماراني را كه دچار انفاركتوس ميوكارد شده اند را نجات دهند انقلابي را در درمان بيماريهاي قلبي و عروقي ايجاد كرده است . استفاده از فيبرينوليتيك ها موثرترين راه براي درمان بيماران مبتلا به انفاركتوس حاد قلبي بوده و عوامل فيبرينوليتيك سرين پروتئازهايي مي باشند كه با فعال كردن پلاسمينوژن و تبديل آن به پلاسمين باعث شكسته شدن فيبرين و فيبرينوينوژن موجود در لخته مي‎گردند. مهمترين فعال كننده اين گروه گليكوپروتئيني به نام Tissue type Plasminogen Activator (t-PA) مي باشد كه براي اولين بار به صورت يك سرين پروتئاز 70 كيلو دالتوني با 527 اسيد آمينه به دست آمد. مولكول t-PA داراي 4 دامين مي باشد :1) منطقه N ترمينال كه حاوي 47 اسيد آمينه مي باشد و با دامين finger فيبرونكتين همولوگ مي باشد (49-1) ؛ 2) اسيدهاي آمينه 87-50 كه با EGF همولوگ مي‎باشند؛ 3) 2 دامين Kringle كه حاوي اسيدهاي آمينه 176-87 و 232-176 مي باشند و با 5 Kringle پلاسمينوژن همولوگ مي باشند؛4) دامين سرين پروتئاز (527-276) كه حاوي اسيدهاي آمينه Active site در موقعيتهاي His322 ،Asp371 وSer478 مي باشد

فعال كننده هاي پلامينوژن در درمان بيماريهاي قلبي عروقي نقش مهمي دارند در كنار مشكلات توليد و پيچيدگي مراحل تاخوردگي نيمه عمر كوتاه كاربردهاي درماني فرم طبيعي (كامل) را با دشواريهايي مواجه ساخته است . فرمهاي كوتاه شده اي مانند Reteplase فرم هاي غير گليكوزيله اي هستند كه با هدف افزايش نيمه عمر طراحي شده اند. حذف برخي نواحي t-PA (نواحي شامل محل حذف) در اين فرم هاي كوتاه شده منجر به مزاياي در اين داروها گشته است. از طرفي حضور يك قطعه كايمريك با توالي مشخص GHRP با تمايل بالاي اتصال به فيبرين در اين طرح پتانسيل جبران نقيسه كاهش تمايل به فيبرين در فرمهاي كوتاه شده را نشان داد. مطالعات گذشته اهميت حضور آمينواسيدهاي SYQ13 در عملكرد پروتئين را نشان داده است. در اين تحقيق سه آمينواسيد SYQ به قطعه كرينگل 2 و سرين پروتئاز درست مشابه فرم دارويي كوتاه شده موجود (RETEPLASE) افزوده گرديد و قطعه GHRP بالادست اين سازه پروتئين با هدف اتصال به فيبريو قرارگرفت به اين صورت اولا نتايج حاصله قابل مقايسه با فرم دارويي موجود Reteplase نسبت به فرم كامل تنها 30% تمايل اتصال به فيبرين ازخود نشان مي دهد و همين عامل علت عوارض جانبي خونرزي بيشتر از اين فرم مي باشد در صورتيكه فرم پيشنهادي اين طرح با وجود كوتاه شده بودن بدليل قطعه كايمريك توانست 86% فرم كامل اتصال به فيبرين نشان دهد. همچنين در توافق با يافته هاي مقالات گذشته سرعت مهار فرم موتاسيون يافته از KHRR به AAAA در حضور مهاركننده t-PA نسبت به فرم كامل كمتر بود. كه نشان دهنده مقاومت بيشتر فرم موتاسيون يافته به مهاركننده t-PA نسبت به فرم تغيير يافته مي باشد. اين فرم جديد در درمان لخته هاي مجدد ايجادي پس از ليزلخته بدليل غلظت بالاي مهار كننده t-PA مي تواند ثمربخش باشد.