خلاصه توصيف اختراع : ساخت كيت تشخيص مولكولي پي سي آر براي شناسايي ويبرتيو كلرا بر اساس سكانس هاي اختصاصي باكتري وبا بيماري امست كه از طريق آب توسط باكتري وببريو كلرا ايجاد مي شود. اين بيماري در گذشته در ايران به نام مرگامرگي خوانده مي شده است اين باكتري با نوشيدن آب آلوده يا خوردن ماهي نپخته يا خوردن صدف ها وارد بدن مي شود. در ايران بيشترين راه انتقال وبا، سبزي هاي آلوده است. سبزي هايي كه در هنگام كاشته شدن با كود انساني (پساب) تغذيه مي شوند داراي بيشترين آلودگي هستند. وبا در طول تاريخ هفت بار همه گيري جهان گستر داشته است. در قرن نوزدهم چندين بار در اروپا همه گير شد اما امروزه وبا بيشتر در كشورهاي جهان سوم به علت وضعيت ناسالم و غير بربهداشتي آبهاي آشاميدني ديده مي شود. در اين اختراع براي هر يك از سكانس هاي اختصاصي ( CTX B ) باكتري پرايمر طراحي شد نمونه ها كلون گرديد و سپس با نمونه هاي كنترل منفي ارزيابي شد.سپس پس از انجام واكنش نمونه ها الكتروفورز گرديد كه نمونه بر اساس وزن هاي نوكلئوتيدي مختلف كه طراحي شده از يكديگر تفكيك شد. عليرغم موفقيت هاي نسبي بدليل وجود برخي مشكلات علمي و اقتصادي وفرهنگي هنوزدردمهاركامل اين عامل باكتريايي محققين موفق نبوده اند بنابراين يك روش سريع و حساس جهت تشخيص اوليه و كنترل بيماري مورد نياز مي باشد. روشهاي مورد استفاده در آزمايشگاه هاي ميكروبيولوژي جهت شناسايي عامل بيماري وبا بستگي به ويژگيهاي باكتريولوژيك (مورثولوژيك ، بيوشيميايي و ... )استفاد، ميشود. اما همه اين روشها داراي معايب خاص خوداز قبيل صرف زمان ، عدم امكان تشخيص تعداد زياد نمونه در يك زمان محدود وعدم دقت لازم هستند.

خلاصه ساخت كيت تشخيص مولكولي پي سي آر براي شناسايي فراسيسلا تولارمي بر اساس سكانس هاي اختصاصي باكتري تولارمي نوعي بيماري ميكروبي مشترك بين انسان و حيوانات است. كه براساس راه ورود و ميزان ويرولانس عامل بيماري داراي تظاهرات باليني گوناگوني در انسان ميباشد. Francisella tularensis را به عنوان يكي از جنگ افزارهاي بيولوژيك خطرناك تلقي نموده اند زيرا داراي خاصيت عفونت زايي شديد، قابليت انتشار آسان و ظرفيت بالاي ايجاد بيماري و مرگ ميباشد . در اين اختراع براي هر يك از سكانس هاي اختداصي ) tul4 و fopA ( باكتري پرايمر طراحي شد نمونه ها كلون گرديد و هپس با نمونه هاي كنترل منفي ارزيابي شد.سپس پس از انجام واكنش نمونه ها الكتروفورز گرديد كه نمونه بر اساس وزن هاي نوكلئوتيدي مختلف كه طراحي شده بود از يكديگر تفكيك شد. عامل بيماري ،تولارمي بوده وبه مقدار فراوان در حيوانات آلوده يافت شده و از طريق نيش حشرات، تماس مستقيم با بافت آلوده حيوان، استشاق گرد و غبار يا قطرات آلوده، خوردن غذاي آلوده .به عامل بيماري و يا نوشيدن آب آلوده به انسان انتقال مي يابد. تولارمي يك بيماري زئونوز )مشترك بين انسان و حيوان( بوده و بسيار خطرناك مي باشد. مرگ و مير در اين بيماري بسيار بالا بوده و واكسن مناسبي بر عليه آن وجود ندارد. از نظر خطرناك بودن به دليل قابل استفاده بودن به صورت سلاح جنگي در بيوتروريست در كاتگوري A قرار مي گيرد.

سرطان پستان شايع ترين سرطان در زنان، با وقوع بيش از يك ميليون مورد جديد در سال در سراسر جهان مي باشد و علت عمده مرگ و مير ناشي از سرطان در زنان مي باشد.. اين سرطان در صورت تشخيص در مراحل اوليه از شانس بالايي براي درمان برخوردار است. يكي از گيرنده هايسلولهاي سرطاني پستان،فاكتور رشد اپيدرمال انسانيHER-2 مي باشد كه سلولهاي داراي اين گيرنده پيش آگهي بدتري دارند. سلول هاي سرطاني كه از نظر HER-2 مثبت مي باشند به داروهايي مانند آنتي بادي تك دودماني پاسخ داده و پيش آگهي به طور قابل ملاحظه اي بالا مي رود.لذا افراد مبتلا به سرطان پستانكه از نظر اين نشانگر مثبت مي باشند، جهت درمان با اين آنتي بادي انتخاب مي شوند. لازم به ذكر است كه اين پروتئين نوتركيب از جمله گران ترين داروهاي موجود بوده و هزينه هاي زيادي را به بيماران و سيستم بهداشتي كشور تحميل مي نمايد، لذا شناسايي دقيق آن در نزد بيماران از اهميت بسزايي برخوردار مي باشد. در سالهاي اخير رويكرد هاي درماني به دليل اختصاصيت و بالتبع موفقيت بيشتر به سوي آنتي بادي هاي تك دودماني متمايل شده و اين دسته از درمانها طيف وسيعي از تحقيقات پژوهشي دنيا را به خود معطوف كرده است.توليد آنتي بادي¬هاي تك دودماني دشوار و پرهزينه بودهدر نتيجه قيمت اين تركيبات دارويي بالاست وبسياري از بيمارانتوان تهيه آن را ندارند. يكي از دلايل مهم پيچيده و پرهزينه بودن توليد آنتي باديها, استفاده از سلول هاي پستانداران به عنوان سيستم بيان كننده ي اين عوامل است.در سالهاي اخير,استفاده از جايگزين¬هاي ساده و مقرون به صرفه از نظر اقتصادي به عنوان يكياز مباحث اصلي در توليد آنتي بادي تك دودماني مطرح شده است. ناتواني ديگر سيستم هاي بيان مانند گياهان و ميزبان باكتريايي در بيان پروتئين قند دار نيز ممكن است محدوديت¬هايي را براي جايگزيني اين سيستم¬ها بجاي ميزبان پستانداران ايجاد كند. با اين حال، از آنجا كه عملكرد برخي از آنتي بادي ها وابسته به محل قنددار نيست،ميزبان باكتريايي به عنوان يك ميزبان ارزان و با عملكرد آسان، موقعيت مهمي در ميان ديگر ميزبان¬هاي توليد كننده آنتي بادي¬هاي و بويژه قطعات آنها پيدا كرده است. در نتيجه در اين پروژه توليد قطعه آنتي بادي antiHER-2 F (ab')2با استفاده از اپران پلي سيسترونيك در سيتوپلاسم باكتري E.coli صورت گرفت. در اين سيستم، زنجيره¬هاي سبك و سنگين تحت كنترل يك پروموتور بيان مي شوند. به منظور بيان شكل مناسب قطعات آنتي بادي 2F (ab')، برخي تغييرات در منطقه لولا انجام شد. قطعه آنتي بادي طراحي شده مي تواند در امر تشخيص دقيق سرطان هاي پستان با افزايش بيان گيرنده HER-2 به كار رود و با توجه به اينكه آنتي بادي مورد استفاده در تشخيص اين گيرنده از خارج از ايران وارد مي شود دستيابي به يك نمونه داخلي تاثير بسزايي در كاهش هزينه هاي تشخيص خواهد داشت. همچنين با بهينه سازي مراحل توليد و استخراج نهايتا در آينده در جهت درمان و بلوكه كردن گيرنده ذكر شده در سرطان پستان كاربرد خواهد داشت.

موضوع اين اختراع طراحي و ساخت كيت تشخيص مقاومت انتي بيوتيكي بتالاكتاماز وسيع الطيف نوع shv، در زمان 30دقيقه الي يك ساعت ، بدون نياز به تجهيزات پيچيده و با حداقل هزينه مي باشد . مقاومت انتي بيوتيكي باكتريها بخصوص بتالاكتاماز نوع shv منجر به نقص روند درماني بسياري از بيماريهاي شايع و خطرناك، اختلال در عمل هاي جراحي ، شيمي درماني و پيوند اعضامي گردد. ميزان مرگ و مير ناشي از مقاومت انتي بيوتيكي در جهان 700000نفر بطور سالانه تخمين زده شده است .تشخيص سريع و دقيق مقاومتهاي انتي بيوتيكي نقش مهمي در انتخاب انتي بيوتيكهاي موثر توسط پزشكان و مديريت بهتر روند عفونت دارد .جهت تشخيص مقاومت انتي بيوتيكي نوع فوق روشهاي مختلفي از جمله: تست تاييدي فنوتيپي ،تست دو ديسكه سينرژيسم ، تست سه بعدي، تست Eوتست PCRوجود دارد. ا ز معايب روشها ي فوق ميتوان به حساسيت پايين ، هزينه بالا و زمانبر بودن اشاره كرد .تكنيك تكثير هم دماي وابسته به حلقه( (LAMPيك روش تشخيصي منحصر به فرد بوده كه در شرايط هم دما و تنها با استفاده از يك انزيم و 4 پرايمر ويژه عمل مي كند .در اختراع فوق از تكنيك lampبراي رديا بي مقاومت نوع shv استفاده گرديد .افزايش سرعت و دقت رديابي مقاومت نوع shv با استفاده از كيت فوق منجر به بهبود مديريت كنترل عفونتها و كاهش اثار زيان بار ناشي از مقاومتهاي انتي بيوتيكي مي گردد (شكل 1).

نقشه فني اختراع

سياه‌ زخم ‌يك‌ بيماري‌ حاد عفوني‌ و قابل‌ انتقال‌ بين‌انسان‌ و حيوان مي‌باشد و عامل اين بيماري باكتري باسيلوس آنتراسيس "Bacillus anthracis " مي باشد. مخزن‌ اين‌بيماري‌ در دام‌ (عمدتا گوسفند، بز وگاو) بوده‌ و با مرگ‌ و مير بالا و سريعي‌همراه‌ است‌. انسان‌ به‌ صورت‌ اتفاقي‌ درصورتي‌ كه‌ در معرض‌ تماس‌ با دام‌آلوده‌، پوست‌، پشم‌ و فرآورده‌هاي‌ آن‌قرار گيرد يا از گوشت‌ آلوده‌ استفاده ‌نمايد و يا در هواي‌ آلوده‌ به‌ اسپور تنفس‌ نمايد به‌ بيماري‌ مبتلا مي‌شود. بيماري سياه زخم مي تواند به انسان هايي كه با حيوانات آلوده و يا بافت آلوده حيواني سروكار دارند، سرايت كند. ميكروب اين بيماري مي تواند به عنوان سلاح بيولوژيك مورد سوء استفاده قرار گيرد و توليد آن نسبتاً آسان است، لذا در حال حاضر از اهميت خاصي برخوردار شده است. استاندارد طلايي براي تشخيص قطعي باسيلوس آنتراسيس، تست هاي معمول باكتريولوژيك همانند كشت مي باشد. اما كشت باكتري مستلزم صرف زمان و هزينه بالايي بوده و ويژگي و حساسيت پاييني دارد و همچنين نيازمند شرايط امنيت زيستي سطح 4 مي باشد. از سوي ديگر كنترل و مانيتورينگ سياه زخم بخصوص فرم تنفسي بيماري كه به دنبال استنشاق آئروسل هاي عفوني به سرعت منتشر مي شود، بسيار حائز اهميت مي باشد. لذا تشخيص سريع، قطعي و دقيق بيماري در نمونه هاي باليني بدست آمده از افراد بيمار و يا مشكوك بر پايه تكنيك ها و روش هاي تشخيص مولكولي سريع با هدف شناسايي به موقع عامل در مدت زمان كوتاه و عدم نياز به امكانات پيشرفته ارجحيت دارند. در روش هاي تكثير هدف، تكنيك هاي مهمي همچون واكنش زنجيره اي پليمراز (PCR) وجود دارد. علي¬رغم سادگي و مقدار تكثير بالا، نياز به دستگاه ترموسايكلر بسيار دقيق، كاربرد وسيع اين روش را محدود كرده است. از معايب عمده¬ي اين روش ها نياز به تجهيزات بسيار دقيق و گران قيمت براي تكثير و روش هاي پر زحمت و وقت¬گير براي آشكارسازي محصولات تكثير شده، مي باشند. تكنولوژي LAMP براي تشخيص دقيق و سريع باكتري باسيلوس آنتراسيس عامل بيماري سياه زخم، جهت تشخيص آن بدون نياز به ميكروسكوپ، تست هاي سرولوژيكي و يا استفاده از روش هاي مولكولي گران قيمت مانند PCR، بسيار حائز اهميت مي باشد.

فرانسيسلا تولارنسيس عامل بيماري تولارمي (به عنوان بيماري شبه طاعون جوندگان) معرفي شده است. اين پاتوژن به عنوان يكي از جنگ افزارهاي بيولوژيك خطرناك به شمار مي آيد كه داراي خاصيت عفونت زايي شديد، قابليت انتشار آسان و ظرفيت بالاي ايجاد بيماري و مرگ مي باشد، بنابراين در گروه A عوامل بيوتروريستي قرار دارد. اين باكتري قادر به ايجاد عفونت در انسان از طريق پوست، غشاهاي مخاطي، دستگاه گوارش و ريه ها مي باشد. از آنجا كه تولارمي انساني، بيماري نسبتاً نادري است در صورت مواجه شدن با آن ممكن است بوسيله پزشكان با ظن قوي مطرح نگردد و بدون تشخيص باقي بماند. تكنيك تكثير هم دما به واسطه حلقه (Loop Mediated Isothermal Amplification) يا (LAMP) يك روش تكثيري و مولكولي منحصر به فرد بوده كه در اين روش DNA باكتري مي تواند در شرايط هم دما (يك دما) و تنها با استفاده از يك آنزيم تكثير يابد و به دناتوراسيون DNA الگو (مانند PCR) نيازي نيست. كيت LAMP بر اساس تكنيك قوي و جديد تكثير ژن است كه در حال حاضر ابزار تشخيصي سريع و ساده براي شناسايي عوامل ميكروبي مي باشد. كل اين روش بسيار سريع و آسان مي باشد زيرا عمليات تكثير در كمتر از يك ساعت و تحت شرايط هم دما (65 درجه سانتي گراد) انجام مي گيرد. اين روش به كمك يك مجموعه پنج پرايمر اختصاصي كه شش ناحيه متمايز را در ژن پيدا مي كند و به وسيله انكوبه كردن كل مواد و پرايمر ها در يك لوله عمل مي كند. بررسي محصولات تست به كمك كدورت سنجي تيوب ها مي باشد. براي انجام تست مذكور، از بيمار مشكوك به تولارمي خون گرفته مي شود و خون بايستي بلافاصله در تيوب حاوي ضد انعقاد مثل سيترات و ... ريخته گشته تا لخته نگردد. از نمونه خون مشكوك، استخراج DNA باكتري با استفاده از كيت استخراج DNA صورت مي گيرد و در تكنولوژي LAMP استفاده مي گردد.