اين اختراع در زمينه زيست فن آوري پزشكي و توليد آنتي بادي نوتركيب عليه گيرنده ErbB3 است. گيرنده هاي خانواده ErbB نقش مهمي در رشد و پيشرفت انواع مختلفي از سرطان‌ها دارند. توسعه روش‌هاي درماني سرطان پستان بر پايه شناسايي مكانيسم‌هاي بيان و تنظيم ژن‌ها و عملكرد مسيرهاي سيگنالينگ دخيل در سرطان، استوار بوده كه منجر به توليد داروهايي نظير آنتي‌بادي نوتركيب ( Trastuzumab (Herceptin عليه گيرنده ErbB2 گرديد. با اين وجود، سلولهاي توموري با روشهايي مختلف از جمله: انتقال پيام از طريق ساير اجزاي اين گيرنده ها، مانع كار آرايي و ايجاد مقاومت نسبت به اين داروها مي شوند. در اين راستا اختراع حاضر با هدف غلبه بر مقاومت دارويي در سلولهاي توموري سرطان پستان، آنتي بادي نوتركيب، با قابليت بلوك همزمان انتقال پيام از طريق گيرنده‌هاي ErbB2 و ErbB3 ساخته شد. در اين اختراع، پس از توليد سلولهاي پايدار ErbB3 و ارزيابي بيان اين گيرنده در سطح رده سلولي VERO، توليد آنتي بادي نوتركيب ضد گيرنده ErbB3 صورت گرفت. آنتي بادي توليد شده در اين اختراع قادر به مهار رشد سلول هاي سرطان پستان در محيط آزمايشگاه بود. هم افزايي تاثير مهار توام انتقال پيام گيرنده هاي ErbB2 و ErbB3 توسط آنتي بادي توليد شده در اين اختراع نشان دهنده قابليت آن در درمان بيماران مبتلا به سرطان پستان و جلوگيري از پيدايش مقاومت دارويي در اين بيماران است.

در اين پروژه ابتدا طراحي پرايمرقطعه مورد نظر انجام شد و سپس تكثير توالي مورد نظر به روش PCR انجام شد. سپس كلونينگ و تكثير قطعات ژني مورد نظر در TA وكتور انجام شد. تاييد كلونينگ انجام شده به روش PCR تاييد گرديد. سپس استخراج پلازميد از باكتري انجام شد. پس از آن TA وكتور و هم چنين وكتور بياني PGEX توسط آنزيم هاي اختصاصي برش خورد و قطعه مورد نظر جداسازي گرديد. طي عمل لايگيشن قطعه استخراج شده وارد وكتور بياني وارد و كلونينگ انجام شد. پس از تاييد به روش PCR بيان صورت گرفت و سپس تاييد بيان به روش SDS و وسترن انجام شد. در نهايت تخليص پروتئين با استفاده از كروماتوگرافي انجام شد.

اپي توپ هاي ايمونوژنيك B-cell و T-cell از آنتي ژن هاي SAG1، MIC4 وROP18 مربوط به انگل توكسوپلاسما را با استفاده از روش بيوانفورماتيك و نرم افزارهاي آنلاين مختلف پيش بيني كرديم. سازه پروتئيني RMS حاوي سه اپي توپ مشترك سلول B و T از ژن هاي SAG1، MIC4 وROP18 توسط لينكر rigid با بهترين چينش به هم متصل و بعنوان كانديد مناسب واكسن ارائه شد. ساختار دوم و سوم پروتئين پيش بيني شد. بهينه سازي كدون ها بر اساس E. coli k12 انجام گرفت. همچنين ساختار دوم mRNA مربوط به سازه پيش بيني و سازگاري كدون بررسي شد. اين سازه پروتئيني به پلاسميد pET28a+ منتقل گرديد. پلاسميد به باكتري Escherichia coli(E.coli) سويه (BL21) ترانسفورم و باكتري مستعد شد. در نهايت، اين آنتي ژن پروتئيني توليد و پس از تأييد بيان پروتئين به روش SDS PAGE و وسترن بلات با استفاده از كروماتوگرافي ميل تركيبي تخليص گرديد و در ادامه كار جهت ارزيابي ايمني سلولي و خوني در موش هاي BALB/c ايمن شده با اين آنتي ژن، مورد استفاده قرار خواهد گرفت. اين واكسن برخلاف واكسن هاي تهيه شده از انگل هاي زنده يا ضعيف شده، خطر فعال شدن انگل را ندارد و با هزينه كمتر و زمان كوتاه تر به مقادير مختلف قابل توليد است.

اختراع حاضر در زمينه پزشكي و زيست فناوري و در مورد ابداع يك سيستم جهت توليد و ارزيابي آنتي‌بادي‌هاي نوتركيب عليه دامين دايمريزاسيون گيرنده HER2 مي‌باشد. سرطان پستان شايع‌ترين سرطان در بين زنان در كشورهاي توسعه‌يافته و درحال‌توسعه است. در دهه‌هاي گذشته توسعه روش‌هاي درمان سرطان پستان بر فهم مكانيسم‌هاي بيان و تنظيم ژن‌ها و عملكرد مسيرهاي سيگنالينگ دخيل در شروع و توسعه سرطان استوار بوده است. از مشخص‌ترين مثال‌هاي اين نوع درمان، توليد آنتي‌بادي نوتركيب Trastuzumab (Herceptin) عليه گيرنده HER2 جهت درمان بيماران مبتلابه سرطان پستان است. بااين‌حال فاز تقريباً تمامي افرادي كه پاسخ اوليه را به اين دارو نشان مي‌دهند طي كمتر از يك سال به آن مقاوم مي‌شوند. با توجه به عدم كارآمدي آنتي‌بادي Herceptin نسل جديدي از آنتي‌بادي‌هاي نوتركيب به نام Pertuzumab معرفي شدند. ويژگي اصلي اين آنتي‌بادي مهار رشد سلول‌هاي سرطاني از طريق اتصال به دامين دايمريزاسيون گيرنده HER2 مي‌باشد. با اين وجود به علت ساختار ويژه گيرنده HER2 طراحي و توليد آنتي‌بادي عليه دامين دايمريزاسيون آن به‌عنوان يكي از مشكلات بزرگ مطرح است. در اينجا روشي ابداع شده است كه از طريق آن مي‌توان به‌راحتي به آنتي‌بادي‌هاي ضد دامين دايمريزاسيون دست يافت. در اين روش دامين دايمريزاسيون گيرنده HER2 از نظر خصوصيات فيزيكي و ايمونولوژيك مورد بررسي قرار گرفت. سپس با استفاده از اطلاعات به دست آمده يك گيرنده HER2 جديد ابداع و ساخته شد و كه از نظر ساختار و نحوه قرارگيري دامين دايمريزاسيون با گيرنده HER2 طبيعي متفاوت است. گيرنده HER2 جديد به نحوي طراحي شده است كه فاقد چندين اسيدآمينه دخيل در تشكيل دهنده دامين دايمريزاسيون مي‌باشد به صورتي كه پس از توليد در سلول، اين گيرنده فاقد دامين دايمريزاسيون مي‌باشد. با در دست داشتن اين گيرنده جديد از طريق تكنيك subtractive phage display به‌راحتي مي‌توان آنتي‌بادي‌هاي ضد دامين دايمريزاسيون گيرنده HER2 را توليد كرد بعلاوه از اين سيستم در ارزيابي آنتي‌بادي‌هاي موجود نيز مي‌توان بهره گرفت.

سلول هاي بنيادي سرطاني (CSC) عامل متاستاز، عود، هتروژنيتي، مقاومت در برابر عوامل شيمي درماني، راديوتراپي و در نتيجه عدم موفقيت در درمان سرطان مي باشند. فعاليت نا به جاي مسير Wnt نقش مهمي در تشكيل و حفظ انواعي از CSC ها از جمله سرطان پستان، سرطان هاي دستگاه گوارش، سرطان ريه و سرطان پوست دارد. از آنجاييكه سيگنالينگ Wnt در خودبازسازي، تومورزايي و تمايز سلول هاي سرطاني به CSC ها نقش دارد، هدف قرار دادن CSC ها با مهار سيگنالينگ Wnt مي تواند رويكرد درماني اميدوار كننده در درمان سرطان باشد. مسير Wnt از ده گيرنده FZD و نوزده ليگاند Wnt تشكيل شده است. از بين اعضاي خانوادهFZD ، FZD7 در انواع مختلف سرطان ها افزايش بيان دارد. افزايش بيان گيرنده FZD7 با متاستاز، عود و مقاومت دارويي سلول هاي سرطاني ارتباط مستقيم دارد. در اختراع حاضر كه براي اولين بار در كشور انجام شد، دمين خارج سلولي گيرنده FZD7 (FZD7 CRD) به روش نوتركيب توليد شد. به علاوه، FZD7 CRD در مهار تكثير و القا آپوپتوز سلول هاي سرطان معده AGS و سرطان كولون SW480 مورد بررسي قرار گرفت. FZD7 CRD محلول مي تواند مسير سيگنالينگ Wnt / β-catenin را توسط اتصال رقابتي با ليگاند هاي Wnt مهار نمايد كه در نتيجه از اتصال ليگاند هاي Wnt با گيرنده هاي FZD7 سطح سلولي ممانعت مي شود. بنابراين پروتئين نوتركيب FZD7 CRD با مهار مسير Wnt مي تواند در ممانعت از تشكيل و حفظ سلول هاي بنيادي سرطاني اثرگذار باشد.

يكي از بزرگترين مشكلات امروزه، سرطان مي باشد. استفاده از راهكارهاي درماني نوين و متناسب با نوع تومور، تاثير بسزايي در بقاي بيمار و بهبود كيفيت زندگي دارد. سرطان پستان شايعترين بدخيمي در بين زنان ايراني است. در حال حاضر استراتژي‌هاي درماني در سرطان هاي HER2 positive، جلوگيري از دايمريزاسيون گيرنده HER2 و درنتيجه مهار مسير هاي سيگنالينگ پايين دست مي‌باشد. به دنبال مقاومت دارويي بالاي نسل اول درمان هاي آنتي بادي ضدگيرنده HER2 (دامين IV)، درمان هاي نوين اختصاصي دامين II مي باشند كه به نام مهارگرهاي دايمريزاسيون HER2 يا (HER2 dimerization inhibitor) معرفي شدند. ازطرفي استفاده از قطعات آنتي بادي نوتركيب نظير ScFV وVHH يا نانو بادي در تحقيقات، پزشكي، بيوتكنولوژي و علوم دارويي به دليل ويژگي هايي مانند قابليت نفوذ بيشتر، توانايي شناسايي آنتي ژن با اختصاصيت و ميل تركيبي بالاتر، اندازه كوچك و توليد آسان، در مقايسه با آنتي بادي كامل رو به افزايش است. بيان و خالص سازي قطعات آنتي بادي نوتركيب با پايداري و حلاليت بالا به وسيله سيستم باكتريايي ارزان تر و نسبت به توليد آنتي بادي هاي مونوكلونال به زمان كمتري نياز دارد. هدف از اين اختراع، توليد آنتي بادي هاي نوتركيب تك دامين (نانوبادي)، عليه دامين دايمريزاسيون گيرنده HER2 مي باشد. recombinant single domain Ab (Nanobody) production against dimerization doamin of HER2 receptor